莱茵衣藻标志蛋白质鉴定及油脂合成相关蛋白质表达研究

摘要

人类对化石能源的过度使用带来了环境污染和能源危机等一系列问题，开发高效、洁净、可循环利用的新型生物能源是缓解能源和环境压力的有效途径之一。由于油脂含量高、生物柴油能效高、固定二氧化碳效率高、大规模培养、生产条件相对简单、不与农争地、不与人争粮、品种资源丰富等优势，微藻被认为是最有前景的第三代生物能源来源。 随着全基因组测序工作的完成和突变体库的建立，莱茵衣藻已成为分子生物学研究的模式生物，被用于油脂合成、逆境应答、光合作用、呼吸作用、鞭毛运动、生物固碳、外源蛋白质表达等生物过程研究中。“组”学技术的应用可使研究者高通量地筛选与重要生物过程相关的基因，但“组”学技术关注特定基因和特定途径的“靶向”性不强。本研究采取了基于抗体和基于质谱MRM的2种“靶向”蛋白质组学研究策略，筛选鉴定了多种胁迫处理条件下莱茵衣藻的内参和标志物蛋白质，并对油脂合成途径中的重要蛋白质表达特征进行了分析，主要研究结果有: 1.以对数生长期的莱茵衣藻为材料，进行正常、暗、冷、热、盐和糖处理，对比了莱茵衣藻培养物在6种处理，5个时间点（0天、1天、2天、4天、6天）的表型差异、细胞密度和总蛋白质变化，发现在试验条件下，热胁迫对莱茵衣藻生长影响最大，细胞密度和蛋白质总量均明显下降，冷、暗、盐和糖处理对莱茵衣藻细胞密度和蛋白质总量的影响相对较小。 2.通过免疫印迹系统分析了20个候选蛋白质在不同处理和不同时间点的表达特征，根据蛋白质丰度变化与细胞密度、总蛋白质含量之间的相关性，确定推荐的对照培养的内参为OEE2和BCR1，暗处理条件下的内参为RK1和ATPs-A，冷胁迫条件下的内参为RMT1，热胁迫条件下的内参为ATPs-A，盐处理条件下的内参为HistoneH3、PD1和ATPs-6，葡萄糖处理条件下内参为RMT1、ATPs-6和GAP2。 3.综合评价多个时间点的丰度变化倍率，根据平均相对倍率的计算，确定推荐的广谱胁迫应答标志物为PRPL18、RBCS2、BCR1和Cre10.g420200，冷处理标志物为ATPs-6，热处理标志物为GAP2、Cre17.g734900和HSP70A，葡萄糖处理标志物为FAB2。 4.对莱茵衣藻进行正常培养和缺氮处理，比较了莱茵衣藻在2种生长条件下5个时间点（0天、1天、2天、4天和6天）培养物的差异。与对照相比，缺氮胁迫导致培养物颜色淡黄、细胞分裂减缓、总蛋白质合成量下降、细胞内油体增多以及油脂含量升高。 5.以报道的113个油脂合成途径蛋白质中的29个为候选，通过免疫印迹系统调查了它们在正常和缺氮胁迫处理的莱茵衣藻细胞中的表达特征，鉴定到受胁迫诱导上调的蛋白质12个，支持它们在油脂合成途径中可能发挥正调控作用。 6.以报道的113个莱茵衣藻油脂合成途径蛋白质为靶标，采取基于质谱MRM的靶向蛋白质组学策略对缺氮处理的蛋白质样品进行分析，鉴定到30个靶标蛋白质的表达特征。在MRM鉴定的蛋白质中，有8个蛋白质与抗体检测结果重叠，其中4个蛋白质的MRM与免疫印迹结果相互符合，且均为缺氮诱导表达上调。 7.基于文献报道的差异转录和基于质谱的差异表达等数据，选择了22个油脂合成相关蛋白质为候选，制备了抗体并用免疫印迹技术调查了缺氮处理后的表达特征，发现其中13个蛋白质表现缺氮诱导上调。 8.本研究累计制备了72个莱茵衣藻蛋白质特异的抗体，并对多种胁迫处理不同时间点的蛋白质样品进行了免疫印迹分析，蛋白质表达特征数据对了解基因的功能具有特殊的意义，所制备的抗体也将是蛋白质相关及其它生物过程机理研究的重要资源。

目录

声明

摘要

缩略词

1．1微藻及其应用前景

1．1．1微藻生物能源

1．1．2微藻固碳

1．1．3微藻作为外源蛋白质的表达系统

1．2微藻细胞油脂合成机理

1．2．1微藻油脂的合成代谢途径

1．2．2藻种筛选及诱导培养

1．2．3微藻的大规模培养

1．3莱茵衣藻

1．3．1莱茵衣藻基因组测序

1．3．2莱茵衣藻突变体库及应用

1．3．3莱茵衣藻TAG合成途径中的重要蛋白质

1．3．4莱茵衣藻非生物胁迫应答

1．4莱茵衣藻的内参蛋白质

1．4．1内参蛋白质及其用途

1．4．2常见的微藻内参蛋白质

1．4．3内参蛋白质应用中的问题

1．5逆境胁迫应答的蛋白质标志物

1．5．1蛋白质标志物及其用途

1．5．2莱茵衣藻的标志物蛋白质

1．5．3蛋白质标志物应用中的问题

1．6“组”学技术在莱茵衣藻研究中的应用

1．7本研究的目的与意义

2．1．1莱茵衣藻藻种

2．1．2培养基

2．1．3基因克隆表达试验所用工程菌及质粒载体

2．1．4主要试剂

2．1．5主要仪器设备

2．2试验方法

2．2．1试验方法藻种的复壮、杂菌去除及单克隆藻种的获得

2．2．2莱茵衣藻预培养

2．2．3莱茵衣藻非生物胁迫

2．2．4莱茵衣藻表型观察与取材

2．2．5总蛋白质的提取与定量

2．2．6重组抗原的制备

2．2．7多肽抗原的分析及抗体制备

2．2．9免疫印迹检测(Western blot，WB)

2．2．10数据的采集与统计分析

2．2．11细胞内油体的显微观察

2．2．12中性脂含量测定

2．2．13总酯含量测定

2．2．14 MRM蛋白质提取

2．2．15 MRM蛋白质的酶解

2．2．16肽段的纯化

2．2．17混合样本质谱检测

2．2．18 MRM方法建立

3．1藻种的纯化

3．2莱茵衣藻液体生长曲线

3．3非生物胁迫对莱茵衣藻生长的影响

3．3．1细胞密度的变化

3．3．2莱茵衣藻培养物的表型变化

3．3．3总蛋白质含量的变化

3．4标志蛋白质的选择

3．5抗原蛋白质的表达、合成及抗体制备

3．6抗体特异性验证

3．7候选蛋白质的表达特征

3．7．1结构与信号受体类蛋白质

3．7．2光合作用类蛋白质

3．7．3代谢相关类蛋白质

3．7．4其它蛋白质

3．8内参蛋白质的筛选

3．9标志物蛋白质的筛选

3．10油脂合成目标蛋白质的选择

3．11多肽抗原设计及抗体制备

3．12正常／缺氮培养莱茵衣藻表型观察

3．12．1培养物颜色变化

3．12．2细胞密度变化

3．13缺氮胁迫对细胞形态与中性脂合成的影响

3．14中性脂和总脂含量测定

3．15总蛋白质含量变化

3．16油脂合成途径重要蛋白质的表达特征

3．16．1脂肪酸合成蛋白质

3．16．2脂肪酸去饱和酶FAD7蛋白质

3．16．3半乳糖脂合成蛋白质

3．16．4磷脂合成蛋白质PIS1

3．16．5硫脂合成蛋白质

3．16．6二酰甘油三甲基高丝氨酸合成蛋白质

3．16．7 TAG合成相关蛋白质

3．16．8油体结构蛋白质

3．16．9脂类运输相关蛋白质

3．16．10脂肪酶蛋白质

3．16．11 β-氧化途径相关蛋白质

3．16．12调控蛋白质

3．17 MRM蛋白质提取与定量

3．18 MRM鉴定结果

3．19靶标蛋白质的丰度变化

3．20油脂合成相关蛋白质的选择

3．21多肽抗原设计及抗体制备

3．22候选蛋白质的表达特征

3．22．1基于RNA-Seq数据确定的候选蛋白质

3．22．2基于质谱技术确定的候选蛋白质

3．22．3基于RT-PCR数据确定的候选蛋白质

3．22．4基于遗传学试验确定的候选蛋白质

3．22．5基于同源性分析确定的候选蛋白质

四、小结与讨论

4．1莱茵衣藻非生物胁迫应答

4．2莱茵衣藻内参及标志物蛋白质的筛选鉴定

4．3莱茵衣藻油脂合成途径重要蛋白质的表达特征研究-基于抗体的策略

4．4莱茵衣藻油脂合成途径重要蛋白质的表达特征研究-基于质谱MRM的策略

4．5莱茵衣藻油脂合成相关蛋白质的表达特征分析

5．1总结

5．2展望

参考文献

附录

在读期间发表的论文

作者简历

致谢