小干扰RNA抑制猪流行性腹泻病毒在Vero细胞内的复制

摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus PEDV)引起一类急性、高度接触性传染病。猪感染PEDV可引起肠道疾病，临床症状主要是仔猪的腹泻、呕吐和脱水。目前，该病在猪场频频暴发给养猪业造成了巨大的经济损失，因此研究预防和治疗PED的新制剂对于PED的防控具有重要的科学意义。RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象是自然界中机体的一种防御机制，它也是一种强大的基因沉默技术。RNAi是指生物体外源或者内源dsRNA(double-stranded RNA)介导产生特异性的转录后基因沉默的现象，RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RTSC）降解靶mRNA。RNAi作为一种基因阻断技术，它凭借着灵敏特异性的优点广泛应用在基因功能研究及人类疾病治疗等领域。本研究拟通过RNA干扰技术来抑制猪流行性腹泻病毒在Vero细胞内的复制作用。
　　PEDV M和N基因在不同毒株之间保守性都很高。其中M蛋白是病毒囊膜的主要组成成分，是跨膜糖蛋白，在病毒装配过程中起到重要作用，N蛋白与病毒基因组RNA构成螺旋核衣壳结构，在病毒进入细胞过程中起到很大的作用，同时也参与病毒颗粒组装和释放过程。M和N基因都是PEDV基因组中的重要基因，均参与病毒的复制。本研究以PEDV的M和N基因为靶基因，筛选出2个small interfering RNAs(siRNA)序列，然后设计1个与PEDV基因组没有同源性的siRNA序列作为阴性对照。继而合成编码三对shRNA型的核苷酸链。将单链核苷酸经过退火形成双链，分别将3对双链DNA连接克隆至pGenesil-1质粒载体的启动子下游，经过测序成功构建了针对PEDV特异的pGenesil-M和pGenesil-N2个siRNA表达质粒和1个阴性对照质粒pGenesil-NC。
　　在脂质体介导下将构成的3种质粒分别转染到Vero细胞，经G418筛选及PCR鉴定后，最终建立3个阳性重组细胞系。不同细胞系接种PEDV48h后，检测病毒的TCID50观察病毒滴度的变化，应用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒的mRNA水平，Western-blotting检测蛋白合成表达情况。在转染特异性pGenesil-M和pGenesil-N质粒的Vero细胞中，检测其病毒滴度、mRNA和蛋白水平均低于转染pGenesil-NC的阴性对照和未转染质粒的阳性对照。PEDV特异性pGenesil-M和pGenesil-N表达质粒能够不同程度地抑制病毒在Vero细胞中mRNA水平及M、N蛋白的合成，且pGenesil-N质粒的抑制作用显著高于pGenesil-M质粒。综上所述，本研究证明靶向PEDV的M和N基因的siRNA能够有效抑制PEDV在Vero细胞内的增殖。靶位不同的siRNA其抑制效果存在一定的差异。这些结果为研发防治PED的新制剂提供了科学依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1猪流行性腹泻病毒概述

1．1．1 PED的流行病学

1．1．2 PED的临床症状及病理变化

1．1．3 PEDV的病原学

1．1．4 PEDV的基因组结构及编码蛋白

1．1．5 PEDV的诊断

1．1．6 PED的疫苗研究情况

1．2 RNA干扰的研究进展

1．2．3 RNAi技术的应用

1．3研究目的和意义

2．1细胞与病毒

2．2主要试验仪器

2．3试验所需主要试剂

2．4主要试剂的配置

2．4．3培养基的配置

2．4．4细胞培养时所使用的溶液

2．5．2 PEDV的增殖传代

2．5．3 PEDV细胞毒的鉴定

2．6设计siRNA序列及构建pGenesil-shRNA质粒

2．6．1选择设计siRNA序列

2．6．3表达质粒pGenesil-shRNA的构建

2．7重组质粒pGenesil-sbRNA瞬时转染Vero细胞及G418筛选细胞系

2．7．1质粒瞬时转染Vero细胞

2．7．2利用G418筛选高效稳定表达质粒的Vero细胞系

2．8表达不同质粒的Vero细胞系感染PEDV

2．9不同样品中PEDV感染滴度的测定

2．10应用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测抑制效果

2．10．2管家基因β-actin TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

2．10．3应用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测

2．11病毒蛋白Westem-blotting检测

3．1 PEDV细胞毒PCR检测结果

3．3重组质粒pGenesil-shRNA瞬时转染Vero细胞及G418筛选细胞系

3．3．1重组质粒的瞬时转染结果

3．3．2 G418筛选细胞系

3．4不同样品中病毒感染滴度测定结果

3．5应用TaqMan实时荧光定量PCR对RNA干扰效果的检测结果

3．5．2管家基因β-actin TaqMan实时荧光定量PCR准曲线的建立结果

3．5．3 TaqMan实时荧光定量PCR检测结果

3．6针对PEDV M和N蛋白表达检测结果

4讨论

4．1 PEDV M和N基因的siRNA筛选及表达质粒的构建

4．2不同重组质粒转染Vero细胞及细胞系的建立

4．3质粒表达的siRNA对PEDV在Vero细胞内复制的抑制效应

5结论

参考文献

作者简介

致谢