沙城产区龙眼葡萄相关酵母菌生物多样性研究及优良酵母菌种的筛选

摘要

葡萄酒的发酵过程是一个复杂的微生物变化过程，酵母菌是发酵过程的主导。龙眼葡萄是我国特有的葡萄品种，本研究从沙城葡萄酒产区龙眼葡萄园生态环境和酒厂环境中分离酵母菌种，利用传统形态分类的方法将分离得到的酵母菌株进行初步分类，再在形态分类的基础上利用分子手段进行区分和鉴定，最后对筛选出的酿酒酵母菌株进行葡萄酒酿造试验，初步筛选出适合龙眼干白葡萄酒酿造的本地酵母菌株。本研究对葡萄酒产区酵母种质资源的探明以及筛选优良的本地酵母菌株具有重要意义。
　　 首先，酵母菌株的分离和初步形态区分：本研究于2008～2009年从河北沙城酿酒葡萄产区的怀来县沙城镇沙营、夹河和东水泉三个自然村的龙眼葡萄园，沙城长城葡萄酒有限公司酿酒车间，采集葡萄园土壤样品、葡萄果表样品、葡萄鲜汁样品、自然发酵过程葡萄汁样品和设备表面样品共计184份。从不同来源的样品中共分离、保藏酵母960株，通过传统形态区分的方法，利用WL培养基对这960株酵母进行初步形态鉴定，结果区分为16个不同培养类型的酵母。其中，葡萄园土壤中的酵母种类最为丰富，有9类；自然发酵过程其次，有8类；而设备表面只分离到3类不同形态的酵母。
　　 其次，利用分子生物学的方法对从不同来源分离得到的不同培养形态的酵母进行区分和鉴定：本研究采用两种分子手段区分酵母菌株，分别是核糖体5.8S-ITS区域PCR-RFLP的方法和核糖体26S D1/D2 区域PCR-RFLP的方法。利用核糖体5.8S-ITS区域的序列分析方法将酵母鉴定到种的水平。结果显示：SDS热裂解法(菌落PCR提取扩增模板)是一种快速、简单、最适合本实验的酵母DNA提取方法。利用5.8S-ITS区域的RFLP的方法，结果显示在连续两个酿酒年份沙城葡萄酒产区分离得到的酵母共获得16类酶切图谱类型；利用序列分析的方法将9类酵母鉴定到种的水平，分别是梅奇氏酵母(Metschnikowia spp.)；酿酒酵母(Saccharomyces bayanus×Saccharomyces cerevisiae)；伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)；假丝酵母(Candida zemplinina)；东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)；膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefacien)；浅黄隐球酵母(Cryptocococcus flavescens)；有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。研究发现不同酿酒年份，不同来源的样品分离得到的酵母，其生物多样性组成各不相同，但最常见的是酿酒酵母(Saccharomyces bayanus×Saccharomyces cerevisiae)。利用核糖体26S D1/D2区域的RFLP的方法能将2008酿酒年份分离得到的10种不同形态的酵母在分子水平上区分为10类，这种方法对于酵母菌种的区分鉴定非常有效。
　　 最后，本研究利用筛选得到的两株酿酒酵母菌株DHS-1和CZ-1进行葡萄酒酿造试验，利用商用活性干酵母CY3079作为实验对照，结果显示，接种CZ-1酵母进行发酵，其发酵速率最快，但降糖速度较慢；发酵结束后原酒的酸度最高；而酵母菌株DHS-1在酿造特性上体现出来更快的降糖速度，用其酿制的龙眼葡萄原酒总酸的含量最低，残糖量低于2 g/l，且口感协调，初步认为DHS-1是适合龙眼葡萄酒酿造的本地酵母菌株。对于紫北赛、烟73、赤霞珠这3种红葡萄品种，利用前两种葡萄接种DHS-1在发酵过程中表现出的降糖速度、可溶性固形物降低速度、葡萄原酒的酸度以及色度这些指标都要优于接种安琪酵母，而赤霞珠葡萄则相反，说明DHS-1同样适合紫北赛和烟73红葡萄酒的酿造。
　　 总之，本研究利用传统形态区分的方法，将分离得到的酵母菌株分为16类，显示了沙城产区龙眼葡萄相关酵母菌群组成的多样性。利用分子手段将这16类酵母在分子水平上进一步区分，并且将其中9种酵母鉴定到种的水平，显示了产区酵母的基因多样性。通过葡萄酒酿造试验，初步筛选出了适合龙眼葡萄酒酿造的本地酵母菌株DHS-1。同时，这种酵母也是适合紫北赛和烟73红葡萄酒酿造的酵母菌株。