人乳头瘤病毒和EB病毒感染与上消化道肿瘤相关性研究

摘要

目的：
　　 1. 研究人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染与食管癌（esophagealcarcinoma，EC）发生的相关性：检测我国不同区域EC 患者癌组织中HPV 感染率及其型别，了解我国不同区域EC 组织中HPV 型别分布特性；检测HPV16 E2/E6基因比率，分析EC 样品中HPV16的整合状态；检测HPV 整合在染色体的位置，以及通过对我国已发表的有关HPV 与EC相关文献的Meta分析，探讨HPV 感染与我国EC发生的病因学关系。
　　 2. 研究EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与胃癌发生的相关性：通过对PubMed数据库中的有关EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）与胃癌相关文献的Meta分析，探讨EBV 感染与胃癌发生的相关性；构建携带EBV 编码BARF1基因的真核表达载体，为今后建立EBV 感染体外模型奠定基础，以便进一步探讨EBV 感染与胃癌发生的病因学关系。
　　 方法:
　　 1. 应用HPV L1基因区通用引物PGMY09/11和GP5+/6+，进行巢式聚合酶链反应（nested polymerase chain reaction，NPCR）；应用HPV（包括HPV16、HPV18）E6-E7基因保守区的简并引物，及HPV16 E6、HPV18 E6 型特异引物进行巢式多重聚合酶链反应（nested multiplex Polymerase chain reaction，NMPCR)，检测EC组织中HPV16和HPV18两型别；分析我国不同区域EC 标本中HPV 感染状况。
　　 2. 应用HPV16 E2和E6 引物进行实时荧光PCR 扩增，检测HPV16 E2 与E6的含量，通过E2 与E6的比率，确定HPV 整合状态；用β-actin 引物进行荧光PCR 扩增，检测每一样品中β-actin 含量，通过HPV16E6 与β-actin 之比，估算HPV16的病毒载量。
　　 3. Oligo(dT)17-P3 引物反转录PCR 扩增cDNA的第一链，HPV E7 特异P1 forward与P3 reverse 引物第一轮扩增，HPV E7 特异P2 forward 与Oligo(dT)17-P3 reverse 引物第二轮扩增，将第二轮产物连接到pMD-18T 载体，进行测序分析，分析HPV 整合在人染色体的位置。
　　 4. 确定文献选择与剔除标准后，以HPV和食管癌为关键词，在国内万方网和中国知网，检索有关HPV 与食管癌相关的研究论文，依据Cochrane 系统，按照Mantel–Haenszel方法，对文献数据作出异质性检验，应用随即效应模型，计算各项研究文献中食管癌病例组和正常对照组中HPV的优势比（odds ratio，OR）、权重（weight）、95％可信区间（95％CI）及合并后的权重和95％CI。数据处理采用Review Manager 4.2 软件完成，以P＜0.05 为差异有显著性。进一步验证HPV在我国食管癌发生中的病原学作用。
　　 5. 确定文献选择与剔除标准后，以EBV和胃癌为关键词，在PubMed 数据库中，检索有关EBV 与胃癌相关的研究论文，依据Cochrane 系统，按照Mantel–Haenszel 方法，对文献数据作出异质性检验，应用随机效应模型，计算各项研究文献中EBV相关胃癌与临床病理特征的优势比（odds ratio，OR）、权重（weight）、95％可信区间（95％CI）及合并后的权重和95％CI。数据处理采用Review Manager 4.2 软件完成，以P＜0.05 为差异有显著性。进一步验证EBV在胃癌发生中的病原学作用。
　　 6. 根据GenBank 提供的cDNA 序列，设计特异性引物，构建BARF1基因的真核表达载体。
　　 结果：
　　 1. 从收集的食管癌患者标本中检测HPV 感染的阳性率：河南省林州市为93.2％（109/117）；河北保定市为88.1％（37/42）；四川省盐亭市为95％（19/20）。它们主要以HPV16 型出现，其次是HPV18 型：HPV16 型阳性率分别占59.6％（65/109）、51.4％（19/37）
　　 和57.9％（11/19）；HPV18 型分别占阳性率的19.3％（21/109）、21.6％（8/37）和21.1％（4/19）。
　　 2. 荧光PCR 结果显示：32例HPV16E6 阳性标本中，检测到6.3％（2/32）为纯游离型、84.3％（27/32）为游离/整合的混合型、9.4％（3/32）为完全整合型，说明病毒DNA 与宿主基因组整合很普遍；这些标本的病毒载量大约在0.066-65.2 拷贝/细胞之间。
　　 3.序列分析结果显示，有两位HPV18 阳性的食管癌患者，其HPV18 整合于患者5号染色体上。
　　 4. 入选17 篇文献食管癌组织标本HPV 检出率为44.0％，正常对照组织HPV 检出率为16.7％，食管癌组织中HPV 感染率与正常对照组织相比具有统计学意义（P＜0.05）；
　　 有12 篇文献进行了HPV16 型特异性检测，其结果显示，食管癌组织标本中HPV16 占38.6％，正常组织标本中HPV16 占15.9％，HPV16 感染率与正常对照组织相比具有显著性差异（P＜0.05）。被检标本分布在河南、广东、新疆、四川、河北、上海、福建和香港八个区域，其HPV 感染与地域分布存在显著性差异（P＜0.05）。
　　 5. 22 篇入选文献中收集的胃癌病例5475例，检测到EBV 阳性病例411例。在EBV阳性胃癌中，男性检出率为11.1％，女性检出率为3.0％；EBV 阳性胃癌与阴性胃癌相比具有较少的淋巴结转移；残胃癌中EBV 感染率为28.3％；EBV 感染与组织学分型及标本类型无显著相关性（p＞0.05）。
　　 6. 以两端添加酶切位点的特异性引物，进行PCR 扩增，得到与预期目的基因片段大小相符的666bp的片段；克隆至载体后，经双酶切和测序分析，确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his 真核表达载体。
　　 结论：
　　 1. 河南省林州市、河北省保定市及四川省盐亭市食管癌样品中，HPV 检出率分别为93.2％、88.1％和95.0％，平均阳性率为92.2％；其中，HPV16和HPV18 两型别平均检出率分别为53.1％和18.4％，说明HPV16和HPV18 两型别在我国具有较高的分布频率。提示HPV16和HPV18 两型别可能在食管癌发生中具有普遍意义。
　　 2. HPV16 阳性食管癌样品中，病毒DNA 与宿主基因整合很普遍，提示HPV 感染可能是食管癌发生的重要病原因子。
　　 3. 部分HPV18 可能整合在人5 号染色体，推测HPV基因组在宿主细胞染色体上整合后，形成HPV 持续性感染，是细胞转化及癌变的关键。
　　 4. Meta分析显示，我国食管癌组织中HPV 感染与正常组织相比具有显著性差异（p＜0.05），并且高危型HPV 感染在不同地域普遍存在。这些结果进一步证实高危型HPV感染是食管癌发生的重要病原因子。
　　 5. EBV 感染仅发生在癌组织细胞中，并且与患者性别、淋巴结转移、癌组织发生部位显著相关（p＜0.05），与患者癌组织学分型、标本类型无显著相关性（p＞0.05）；提示，EBV 阳性胃癌具有独特的临床病理学特征，EBV 感染与部分胃癌的发生密切相关。
　　 6. 成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/BARF1-his，为今后建立EBV相关胃癌研究的体外模型奠定了基础。