MiRNA抑制山羊副流感病毒3型复制的机制研究

摘要

山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type3,CPIV3）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）呼吸道病毒属（Respirovirus）中的一员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒能通过气溶胶进行水平传播，相邻健康羊只感染后出现与患羊相同的咳嗽、体温升高、流鼻涕、精神沉郁等临床症状。感染羊只可通过多种途径向外排毒，严重感染时可在血液中检出病毒，这为该病的防控增加了难度。研究证实，宿主细胞微小核糖核酸（Micro-ribonucleic acid,miRNA）是宿主-病原体相互作用的复杂网络中不可或缺的调节因子，miRNA通过间接作用于某个细胞成分影响细胞内通路和调节先天性免疫应答，在抗病毒感染和复制方面扮演了重要角色。 在前期研究中，将CPIV3接种牛肾细胞（Madin-darby bovinekidneycells,MDBK）后，通过高通量测序技术获得了249个差异表达的miRNA，其中bta-miR-98与bta-miR-222在感染组中下调。GO注释与KEGG富集分析发现，bta-miR-222在抗病毒方面与先天性免疫中有重要作用，bta-miR-98通过调控细胞凋亡来影响病毒复制。本研究通过体外转染bta-miR-98与bta-miR-222模拟体的方法，探索miRN A抑制CPIV3复制的分子机制，为该病的防控奠定理论基础。 1.细胞内bta-miR-222靶向IRF2抑制CPIV3复制的分子机制 为探讨bta-miR-222对CPIV3复制的影响及其机制，本研究将bta-miR-222模拟体转染MDBK细胞，接种CPIV3病毒液，收集上清和细胞，测定病毒效价和干扰素（Interferon,IFN）含量；通过TargetScan和miRBase等生物信息学软件预测bta-miR-222调控的靶基因，用双荧光素酶报告系统验证其靶基因，RN A干扰技术研究靶基因对CPIV3复制的影响。 结果显示，bta-miR-222模拟物能抑制CPIV3复制，转染bta-miR-222组IFN的表达水平较高，且病毒复制效价（102.5TCID50/0.1mL）显著低于miRNA阴性对照组（103.3TCID50/0.1mL）；双荧光素酶报告系统、RT-qPCR与Western blot检测结果显示，bta-miR-222可靶向结合干扰素调节因子2（Interferon regulatory factor2,IRF2）的3′UTR，并降解IRF2的mRNA和抑制IRF2蛋白表达；敲除IRF2的MDBK细胞感染CPIV3后，病毒复制效价（102.0TCID50/0.1mL）低于正常MDBK细胞组（103.2TCID50/0.1mL）。结果表明，bta-miR-222通过靶向降解IRF2mRNA提高IFN表达水平来抑制CPIV3复制，为基于bta-miR-222研制潜在抗病毒药物提供基础资料。 2.细胞内bta-miR-98靶向Caspase3抑制CPIV3复制的分子机制 为检测CPIV3感染MDBK细胞对细胞凋亡(Apoptosis)的影响，本研究将CPIV3接种MDBK细胞24h后，通过RT-qPCR检测半胱氨酸蛋白酶-3（Cysteine protease3,Caspase3）、半胱氨酸蛋白酶-8（Cysteine protease8,Caspase8）与半胱氨酸蛋白酶-9（Cysteine protease9,Caspase9）的mRNA表达水平，试剂盒检测Caspase3、Caspase8与Caspase9酶活性以及流式细胞术检测细胞凋亡水平。化学合成bta-miR-98mimics和bta-miR-98inhibitor，体外转染MDBK细胞24h后接种CPIV3，收集细胞和上清，通过RT-qPCR与TCID50检测CPIV3滴度，试剂盒检测Caspase3酶活性，流式细胞术检测细胞凋亡水平。利用TargetScan与miRBase生物信息学软件预测bta-miR-98的靶基因，双荧光素酶报告系统验证靶基因，RNA干扰技术研究靶基因对CPIV3复制的影响。 结果显示，接毒组Caspase3、Caspase8与Caspase9的mRNA表达水平均比正常细胞高2.5倍左右；接毒组Caspase3酶活性高于对照组3倍、Caspase8与Caspase9酶活性均高于对照组；接毒组细胞凋亡率（9.81%）高于正常细胞（2.93%）。以上数据说明CPIV3能促进细胞凋亡。进一步研究结果显示，转染bta-miR-98mimics能抑制CPIV3增值，病毒复制效价（102.7TCID50/0.1mL）低于miRNA阴性对照（103.3TCID50/0.1mL）；转染bta-miR-98inhibitor能促进CPIV3增值，病毒复制效价（103.5TCID50/0.1mL）高于miRNA阴性对照（103.0TCID50/0.1mL）。转染bta-miR-98mimics能有效抑制MDBK细胞凋亡，转染组细胞凋亡率（24.63%）低于miRNA阴性对照组（28.07%）与正常细胞接毒组（28%）；转染miR-98inhibitor能有效促进MDBK细胞凋亡，转染组细胞凋亡率（32.37%）高于miRN A阴性对照组（27.4%）与正常细胞接毒组（28%）。TargetScan预测bta-miR-98能靶向结合Caspase3的3′UTR，双荧光素酶报告系统、RT-qPCR与Western blot检测结果显示，bta-miR-98可靶向结合Caspase3的3′UTR，并降解Caspase3的mRNA和抑制Caspase3蛋白表达；敲除Caspase3的MDBK细胞感染CPIV3后，病毒复制效价（102.5TCID50/0.1mL）低于正常MDBK细胞组（103.2TCID50/0.1mL）。结果表明，bta-miR-98是通过靶向Caspase3降解其mRNA的表达水平，从而抑制细胞凋亡来抑制CPIV3复制。 3.慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定 为获得稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株，本研究使用PCR技术，从MDBK细胞基因组中扩增pri-bta-miR-222片段，pEGFP-N1质粒中扩增GFP片段，通过胶回收目的片段，先克隆于pMD18-T载体中，转化入大肠杆菌，酶切鉴定及测序正确，再克隆于PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体，构建含bta-miR-222基因的miRNA慢病毒重组质粒PCDH-miR-222-GFP。将PCDH-miR-222-GFP与两个包装质粒PSP、PMD共转染293T细胞，制备含bta-miR-222基因的重组慢病毒VPCDH+miR-222。将制备成功的慢病毒VPCDH+miR-222接种MDBK细胞，经puromycin嘌呤霉素筛选，荧光显微镜观察感染效率。 结果显示，PCDH-miR-222-GFP过表达质粒构建成功，序列比对符合率达100%。将PCDH-miR-222-GFP与PSP、PMD共转染293T细胞后，通过荧光显微镜观察到大量的荧光，说明成功构建了重组慢病毒VPCDH+miR-222，经Puromycin嘌呤霉素筛选10代后，VPCDH+miR-222在MDBK细胞中仍具有感染效率。结果表明，成功获得了稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株，为下一步研究bta-miR-222在病毒感染MDBK细胞中的功能奠定基础。

目录

课题来源

综述一 副流感病毒3型病原学及其检测方法研究进展

1 . P IV3病原学研究进展

1.1 PIV3基因组

1.2 PIV3结构蛋白

1.3 PIV3基因组复制

2 . P IV3检测方法研究进展

2.1 PIV3病原学检测

2.2 PIV3血清学检测

综述二 MiRNA研究进展

1. MiRNA的发现与定义

2. MiRNA识别及靶基因预测

3. 细胞内源miRNA与副黏病毒相互作用

3.1细胞内源miRNA影响副黏病毒免疫反应

3.2细胞内源miRNA影响细胞分裂与细胞凋亡

3.3细胞内源miRNA影响肿瘤生成

3.4细胞内源miRNA对副黏病毒的其他功能

4. MiRNA与CPIV3

5. 本研究的目的及意义

第一章 细胞内bta-miR-222靶向IRF2抑制CPIV3复制的分子机制

1. 材料

1.1 细胞与病毒

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2. 方法

2.2 Bta-miR-222对CPIV3复制的影响

2.3 Bta-miR-222调控CPIV3复制的分子机制

3. 结果

3.1 Bta-miR-222对CPIV3复制的影响

3.2 Bta-miR-222对Ⅰ型干扰素表达的影响

3.3 Bta-miR-222的靶基因预测

3.4双荧光素酶报告基因系统分析bta-miR-222靶基因

3.5 敲除IRF2基因对CPIV3复制的影响

4. 讨论

第二章细胞内bta-miR-98靶向Caspase 3抑制CPIV3复制的分子机制

1. 材料

1.1 细胞与病毒

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2. 方法

2.1 CPIV3诱导细胞凋亡的检测

2.2 Bta-miR-98调控细胞凋亡影响CPIV3复制

2.3 Bta-MiR-98调控细胞凋亡影响CPIV3复制

2.4 Bta-miR-98调控CPIV3复制的分子机制

2.5统计分析

3. 结果

3.1 CPIV3促进MDBK细胞凋亡

3.2 Bta-MiR-98对CPIV3复制的影响

3.3 Bta-miR-98靶基因的预测

3.4双荧光素酶报告基因系统分析bta-miR-98靶基因

3.5 Caspase 3基因敲除对CPIV3复制的影响

4. 讨论

第三章 慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定

1. 材料

1.1细胞与病毒

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2. 方法

2.1引物的设计与合成

2.2 Pri-bta-miR-222与GFP基因片段的扩增

2.3重组PCDH-miR-222-GFP质粒的构建与鉴定

2.4慢病毒VPCDH+miR-222的包装

2.5 VPCDH+miR-222感染MDBK细胞

2.6荧光定量PCR

3. 结果

3.1重组慢病毒表达质粒的构建与鉴定

3.3重组慢病毒的制备

3.4稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株的建立

3.5荧光定量PCR

4. 讨论

全文结论

参考文献

致谢

附录

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