基于氨基酸代谢的腐乳酱风味促熟及机理研究

摘要

腐乳与豆豉、酱油、豆酱并称为我国四大传统发酵大豆调味品。特征风味，作为腐乳品质的关键因素，决定着消费者可接受度，但腐乳生产多沿用传统工艺，风味后熟时间长，质量难以保证。本课题针对腐乳需长期后熟的技术“瓶颈”，以中国八大名优特色腐乳为试材，剖析了其挥发性风味物质和菌群特征，并可视化特征风味物质与优势菌的交互关联，确定潜在风味关联菌株；以主要风味前体氨基酸代谢为切入点，以转氨酶、肽酶、蛋白酶等为指标，筛选高酶活性风味关联菌株制备复配菌剂，构建了腐乳酱促熟模型；基于宏基因组学（Metagenomics）技术，结合生物信息学分析方法，探究了基于氨基酸代谢的腐乳酱风味形成途径。以期为缩短腐乳后熟期提供科学依据，进而为改良传统发酵大豆调味品风味品质提供新思路。主要结论如下： （1）八种特色腐乳理化和呈味特性分析表明，γ-氨基丁酸在细菌型腐乳（KS）中含量高达57.95mg/g DM，是自然发酵腐乳（SS）和毛霉型腐乳（WS）的8倍；必需氨基酸含量为15.23~49.57mg/gDM，其氨基酸模式可与牛奶、鸡蛋媲美。根据氨基酸呈味特征，鲜味和苦味氨基酸所占比重较大，其次为甜味；肽谱分析表明，分子量（MW）＜300Da的呈味肽占主导优势，为79.22%~95.24%；电子舌分析发现，各腐乳苦味相近，但细菌型腐乳（KS）鲜味、涩味和酸味最强。 （2）利用Illumina Miseq高通量测序技术，基于种水平八种特色腐乳中共鉴定出202种细菌和125种真菌，其中优势细菌16种，优势真菌7种。通过斯皮尔曼相关系数（Spearman's rank correlation coefficient，ρ），确定发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、奥默柯达酵母（Kodamaea ohmeri）、鲁氏酵母（Saccharomyces rouxii）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp.）为潜在风味关联菌株。 （3）以转氨酶、肽酶、蛋白酶等为指标，基于隶属函数值，选取发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母和乳酸乳球菌亚种三株高酶活性性风味关联菌株制备复配菌剂，构建腐乳酱促熟模型，其优化工艺参数为：发酵时间15d、发酵温度28℃、菌剂添加量0.10%、菌剂比例2∶1∶1（发酵毕赤酵母：奥默柯达酵母：乳酸乳球菌亚种）、α-酮戊二酸二钠盐0.4%、食盐添加量5%。该工艺条件下的验证试验表明，成熟腐乳酱的总酸和氨基酸态氮含量分别为0.14g/100g和1.35g/100g，优于白腐乳的标准限量值（总酸≤0.35g/100g，氨基酸态氮≥1.30g/100g）。营养功能成分显著增加（p＜0.05），其中γ-氨基丁酸由0.02mg/g DM（豆腐）上升至30.96mg/g DM（腐乳酱），VB2是未发酵前的8倍，为4.97mg/g DM。挥发性风味物质种类达85种，且趋于稳定，其中58种对腐乳酱风味品质有贡献，主要特征风味物质有13种，包括2-甲基丁酸乙酯、2-戊基呋喃、2-甲基丁醛、己醛、辛醛、庚醛、苯乙烯、己酸乙酯、2-戊酮、丁酸乙酯、反式-茴香脑、2,3-戊二酮和苯乙醛。 （4）通过KEGG代谢通路注释，发现氨基酸代谢（Amino acid metabolism）是腐乳酱代谢类通路中占比最高的，其中芳香族氨基酸（Aromatic amino acids）代谢占比最高，达41.3%，其次为支链氨基酸（Branched-chain amino acids），为21.9%，含硫氨基酸（Sulphuric amino acids）占比为6.8%，三者总占比为70%。参与芳香族氨基酸代谢的物种主要有乳酸乳球菌亚种（Lactococcus lactissubsp.）和短杆菌（Brevibacterium lines）；参与支链氨基酸代谢的物种主要有发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）和鞘氨醇杆菌亚种（Sphingobacterium sp.）；参与含硫氨基酸代谢的物种主要有发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、鲁氏酵母（Saccharomyces rouxii）和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。 （5）以宏基因组学为基础，经生物信息学分析，腐乳酱特征风味物质形成的前体氨基酸主要有苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬氨酸等，主要代谢途径为转氨、脱羧、脱氢、氧化反应等，主要关联酶为转氨酶、脱氢酶、脱羧酶、氧化酶、裂解酶等，其中关键限速酶为转氨酶（EC:2.6.1.1、EC:2.6.1.5、EC:2.6.1.6、EC:2.6.1.42、EC:2.6.1.57、EC:2.6.1.58），较好地诠释了苯乙醛、苯乙烯、苯乙醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、2-甲基丁酸、2-甲基丁酸乙酯等风味物质的形成途径。

目录

第一章 前言

1.1 腐乳概述

1.1.1 分类

1.1.2 生产工艺

1.2 腐乳营养与功能成分研究进展

1.2.1 营养成分

1.2.2 功能成分

1.3 腐乳发酵微生物

1.3.1 前酵微生物

1.3.2 后熟主要微生物

1.4 腐乳风味物质研究进展

1.4.1 风味物质研究现状

1.4.2 风味物质形成机理

1.4.3 风味促熟研究进展

1.5 本课题立题背景、依据及意义

1.6 主要研究内容

第二章 腐乳理化及呈味特性量化表征

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料与试剂

2.2.2 主要仪器与设备

2.2.3 试验方法

2.2.4 统计分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 理化特性分析

2.3.2 呈味氨基酸谱剖析

2.3.3 呈味肽谱对比

2.3.4 基于电子舌的滋味鉴别

2.4 本章小结

第三章 不同类型腐乳菌群与特征风味物质的关联剖析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料与试剂

3.2.2 主要仪器与设备

3.2.3 试验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 腐乳特征挥发性风味物质筛选

3.3.2 腐乳菌群特征分析

3.3.3 腐乳特征风味物质和菌群关联剖析

3.4 本章小结

第四章 强化发酵腐乳酱促熟模型构建

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料与试剂

4.2.2 主要仪器与设备

4.2.3 试验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 高酶活性风味关联菌株筛选

4.3.2 高酶活性复配菌剂制备

4.3.3 腐乳酱促熟模型构建

4.3.4 促熟腐乳酱理化动态跟踪

4.4 本章小结

第五章 基于氨基酸代谢的腐乳酱风味形成途径研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料与试剂

5.2.2 主要仪器与设备

5.2.3 试验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 强化发酵腐乳酱特征风味物质筛选

5.3.2 腐乳酱菌群特征剖析

5.3.3 KEGG代谢通路注释

5.3.4 不同菌群的氨基酸代谢功能贡献度分析

5.3.5 基于氨基酸代谢的关联酶及基因分析

5.3.6 基于氨基酸代谢的特征风味物质形成途径网络构建

5.4 本章小结

主要结论

论文创新点

攻读博士期间的研究成果

致谢

参考文献

附图

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