西达本胺逆转淋巴瘤细胞株Pfeiffer/ADM阿霉素耐药的实验研究

摘要

目的： 探讨西达本胺(Chidamide)是否能够逆转弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）细胞株Pfeiffer/ADM对阿霉素(Doxorubicin，ADM)的耐药，并对其作用机制进行初步研究。 方法： 1、CCK8法实验检测各浓度梯度的ADM、西达本胺单药和联合处理Pfeiffer和Pfeiffer/ADM细胞的增殖抑制作用;并计算出药物的IC50和Pfeiffr/ADM细胞的阿霉素耐药指数。 2、采用流式细胞术检测不同浓度药物处理的Pfeiffer/ADM细胞，计算其凋亡率。 3、采用RT-PCR法检测不同浓度药物处理的Pfeiffer/ADM细胞的MDR1mRNA表达水平。 4、采用Western Blot蛋白印迹法检测不同浓度西达本胺处理的各组细胞的组蛋白H3、H4乙酰化水平。 结果： 1.不同浓度ADM(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16μg/mL)分别处理Pfeiffer和Pfeiffer/ADM细胞48h后，Pfeiffer细胞增殖抑制率为（10.45±0.93）％，(31.10±0.98)％,(43.00±0.64)％,(60.00±0.84)％,(81.21±21.8)％。Pfeiffer/ADM细胞增殖抑制率为（11.38±1.95）％、(14.84±2.00)％、(21.28±1.75)％、（26.71±4.31）％、(35.95±2.40)％。比较两者增殖抑制率，ADM的对Pfeiffer细胞的增殖抑制率比Pfeiffer/ADM细胞增殖抑制率高，差异有统计学意义，P＜0.05，计算Pfeiffer/ADM耐药指数为8.4。 2.ADM(0.16μg/mL)处理Pfeiffer/ADM细胞24、48、72h，增殖抑制率为(18.45±1.83)％，(35.95±2.35)％，(52.18±2.56)％，呈时间依赖性。同一浓度ADM处理Pfeiffer细胞24、48、72h，增殖抑制率为(46.74±4.35)％，(81.21±2.20)％，(94.53±0.40)％。结果提示ADM作用于Pfeiffer细胞的抑制率较Pfeiffer/ADM细胞高，呈现时间依赖性，差异有统计学意义，P＜0.05。 3.不同浓度西达本胺(2、4、8、16μmol/L)分别处理Pfeiffer和Pfeiffer/ADM细胞48h。结果显示，细胞均被抑制，并且随着浓度的增加抑制细胞增殖作用逐渐增强，呈浓度依赖性。其中西达苯胺对Pfeiffer细胞的增殖抑制率更强，差异有统计学意义，P＜0.05。 4.同一浓度西达本胺(8μmol/L)分别处理Pfeiffer和Pfeiffer/ADM细胞24、48、72h，Pfeiffer细胞增殖抑制率为(40.57±10.00)％，(66.57±8.82)％，(91.87±4.97)％;Pfeiffer/ADM细胞增殖抑制率为(20.89±2.26)％，(34.07±4.29)％，(50.50±2.21)％，西达苯胺对亲本细胞和ADM耐药细胞均有增殖抑制作用，呈现时间依赖性，差异有统计学意义，P＜0.05。 5.不同浓度西达本胺（0，4，8，16μmol/L）联合固定剂量ADM(0.08，0.16μg/ml)处理Pfeiffer/ADM细胞48h，结果示（0μmol/L C+0.08μg/mLA）、(4μmol/L C+0.08μg/mL A)、(8μmol/L C+0.08μg/mL A)、(16μmol/LC+0.08μg/mL A)组，增殖抑制率分别为（16.91±1.78）％，（48.21±1.35）％，(53.33±2.08)％,(55.23±3.10)％。(0μmol/L C+0.16μg/mLA)、(4μμmol/LC+0.16μg/mL A)、(8μmol/L C+0.16μg/mL A)、(16μmol/L C+0.16μg/mLA)组，增殖抑制率分别为(23.17±2.58)％，(50.58±1.59)％，(56.37±1.82)％，（59.50±2.66）％。不同浓度的ADM(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16g/mL)处理Pfeiffer/ADM细胞48h增殖抑制率(11.38±1.95)％、(14.84±2.00)％、（21.28±1.75）％、（26.71±4.31）％、(35.95±2.40)％。比较各组增殖抑制率，表明西达本胺能恢复Pfeiffer/ADM细胞对ADM敏感性，其作用呈浓度依赖性。差异均有统计学意义，P＜0.05。 6.不同浓度西达本胺(0，4，8，16μmol/L)联合固定剂量ADM（0.08μg/mL）处理Pfeiffer/ADM细胞48h，结果示对照组凋亡细胞百分率为1.6％，ADM联合西达本胺（0μmol/L C+0.08μg/mL A）、(4μmol/L C+0.08μg/mL A)、(8μmol/L C+0.08μg/mL A)、(16μmol/L C+0.08μg/mL A)浓度组凋亡率分别为（5.3±0.12）％，（6.63±0.15）％，(11.13±0.21)％，(16.77±0.15)％，与对照组比较差异有统汁学意义(P＜0.05)。 7.不同浓度西达本胺(0，4，8，16μmol/L)处理Pfeiffer/ADM细胞48h后，结果示4，8，16μmol/L西达本胺作用细胞后能明显降低MDR1mRNA表达水平，相对表达量分别为(9271.13±944.39)，（6600.83±665.04），（158.90±16.41），提示西达本胺能下调MDR1mRNA表达，其作用呈浓度依赖性，差异有统计学意义，P＜0.05。 8.不同浓度西达本胺(0，4，8，16μmol/L)处理Pfeiffer/ADM细胞48h后，Western Blot法检测各组细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平。组蛋白H3乙酰化水平结果分别为(116.54±0.16)，（183.23±0.60），(216.21±2.09)，(243.24±0.75);组蛋白H4乙酰化水平表达量(86.86±0.44)，（162.23±1.58），(210.50±1.34)，(234.35±0.29)。结果显示随着浓度增加，组蛋白H3、H4乙酰化水平升高，差异均有统计学意义，P＜0.05。说明西达本胺能增加Pfeiffer/ADM细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平，其作用呈浓度依赖性。 结论： 1.本研究所使用的Pfeiffer/ADM细胞是ADM中度耐药细胞。 2.西达本胺对Pfeiffer细胞和Pfeiffer/ADM细胞均有增殖抑制和诱导凋亡作用，其效应呈剂量和时间依赖性。 3.西达本胺能恢复Pfeiffer/ADM细胞对ADM的敏感性，其作用机制可能与西达本胺增加Pfeiffer/ADM细胞的组蛋白H3、H4乙酰化水平，下调MDR1mRNA表达水平有关。