TP53 K351N突变体对卵巢上皮性癌铂类耐药的分子机制研究

摘要

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤中最致命的恶性肿瘤。其主要原因是无特殊临床症状;其次，目前缺乏有效的筛选手段;再者，多数卵巢癌恶性程度高，很早就出现盆腔或腹盆腔内广泛种植转移，或者淋巴结转移，导致75％卵巢癌患者就诊时已经处于中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）[1]。自2011年以来，对于晚期卵巢癌患者指南推荐将初始肿瘤细胞减灭术(Primary debulking surgery，PDS)后再辅以铂类为基础化疗作为首选治疗方案。对于无法耐受PDS或者在PDS中无法达到最优切除的患者，推荐的治疗方案是包含基于铂类的新辅助化疗后再行中间性肿瘤细胞减灭术(Neoadjuvant chemotherapy with interval debulking surgery，NACT-IDS)[2]。尽管，随着外科手术技艺进步和全身治疗手段的不断进步和发展，但是，在引入铂类药物的30年来，晚期卵巢癌患者的总生存率几乎没有太大的变化。其主要原因是治疗过程中肿瘤细胞的内源性或获得性耐药。许多研究都已证实了NACT-IDS治疗模式会增加患者产生铂类获得性耐药的风险[3]，而不论其内源性还是获得性耐药，都是改善卵巢癌患者预后的一座大山。因此，进一步阐明卵巢癌产生化疗耐药的机制进而克服或者规避耐药显得十分重要。近年来，分子生物学的飞速发展，也许能在基因层面上找到答案。
　　目的:
　　探究EOC铂类耐药与P53K351N突变的相关性，并且从分子层面上解释其耐药的机制，为临床用药提供理论支持。
　　方法:
　　构建有免疫荧光标记野生型和突变型的P53质粒，用质粒转染人卵巢癌A2780细胞株，通过药物筛选得出P53稳定表达的野生型和突变型的A2780细胞株，并用基因测序验证筛选结果;利用结晶紫法检测顺铂对稳定表达野生型A2780细胞株、稳定表达突变型2780细胞株以及A2780细胞株的生长抑制作用，并对比相互之间的差异;利用流式细胞学技术检测顺铂在相同浓度，相同时间作用下，稳定表达野生型A2780细胞株、稳定表达突变型2780细胞株以及A2780细胞株细胞凋亡率之间的差异;利用蛋白质印迹法（western bolt技术）检测顺铂在相同浓度，相同时间作用下对稳定表达野生型A2780细胞株、稳定表达突变型2780细胞株以及A2780细胞株细胞凋亡相关蛋白caspase3、Bax、Bcl2表达的差异。
　　结果:
　　顺铂对稳定表达野生型组、突变型组以及空白均有生长抑制作用。但是，顺铂对突变型组生长抑制作用最弱，对空白作用次之，对野生型组的生长抑制作用最强。TP53Mut对顺铂的耐受性是TP53Wt的2.65倍(P＜0.05)。通过流式细胞学技术检测，在相同时间、相同浓度的顺铂作用下，突变型组凋亡率最低，空白组次之，而野生型组凋亡率最高。在15h时，TP53Mut组的凋亡率是TP53Wt组的11.4倍;在30h时，TP53Mut组的凋亡率是TP53Wt组的9.55倍（P＜0.05）。凋亡蛋白检测，在相同时间、相同浓度的顺铂作用下，突变组caspase-3蛋白和BAX蛋白表达量最少，Bcl2蛋白表达量最高，说明TP53K531突变能抑制其凋亡活性。与之相反的野生组能上调caspase3蛋白和BAX蛋白表达，下调Bc12蛋白表达，增加其凋亡活性。根据其灰度值，TP53wt组活化的Caspase-3蛋白的相对表达量是TP53Mut组的1.46倍，TP53wt组BAX/Bcl2的比值是TP53Mut组的10.78倍。
　　结论:
　　正常P53基因在面临细胞损伤时，若能修复细胞损伤，则介导细胞的修复，让细胞继续存活;若面临无法修复的细胞损伤，则介导细胞凋亡。顺铂属于细胞毒性药物，通过抑制细胞DNA复制并损伤细胞膜结构，让P53基因无法修复损伤，进而介导细胞凋亡。TP53K351N突变，让细胞即使面临无法修复的损伤时也无法正常介导细胞的凋亡，从而导致突变型A2780细胞对顺铂的耐药。在临床工作中，不论是选择PDS治疗模式还是NACT-IDS治疗模式，如果在化疗前可以检测到了TP53K351N突变，可以指导化疗方案的选择，规避化疗耐药。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1．试验材料

1．1 实验细胞株

1．2 实验试剂与药品

1．3 主要实验仪器与耗材

2 实验方法与技术路线

2．1 总技术路线图

2．2 质粒的构建

2．3 细胞培养

2．4 质粒转染

2．5 转染后验证及稳定转染株的筛选

2．6 结晶紫实验

2．7 流式细胞学技术测凋亡

2．8 蛋白质印迹法western blot检测凋亡蛋白

3．试验结果

3．1 考马斯亮蓝标准曲线的结果

3．2 瞬时转染试验结果

3．3 琼脂糖凝胶电泳图谱

3．4 结晶紫实验结果

3．4 流式细胞学试验结果

3．5 蛋白质印迹法western bolt试验结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢