沼气发酵的物料理化特性及微生物群落多样性分析

摘要

本论文通过研究沼气发酵过程中的物料变化，利用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）对沼气发酵过程不同时期的微生物群落演替及其多样性进行分析，对我们深入研究和阐述沼气发酵过程中的微生物群落的变化规律、微生物群落的功能打下基础，并为提高沼气能源的利用率提供可靠的科学理论依据。
　　 我们在实验室中分别建立了三个牛粪和三个猪粪沼气发酵模拟装置，发酵罐有效容积均为4000 mL，采用批量式常温发酵工艺。以牛粪和猪粪为原料的发酵罐的初始发酵料液pH值分别为6.7和7.0，发酵液起始总固体浓度分别为59.03g/L、92.62g/L。沼气发酵模拟装置投料上罐后，常温下成功发酵3个多月，持续产气约100天。我们对发酵过程中发酵液的pH值、总固体含量（TS）、挥发性固体含量（VS）、总碳含量（TC）和总氮含量（TN）的变化进行了监测，并分析了产甲烷的规律。结果表明：整个发酵过程大致经历了三个阶段：发酵启动期、发酵稳定期和发酵结束期。发酵过程的pH值变化在6.4～7.2之间；牛粪发酵三个罐的产气率分别为0.285 L CH4 g-1VS、0.291 L CH4 g-1 VS和0.282 L CH4 g-1 VS；猪粪发酵三个罐的产气率分别为0.197 L CH4 g-1 VS、0.193 L CH4 g-1 VS和0.213 L CH4 g-1 VS。整个发酵前后的总固体含量（TS）、挥发性固体含量（VS）、总碳含量（TC）、总氮含量（TN）和碳氮比（C/N）都下降。
　　 利用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE），对猪粪沼气发酵过程中的细菌和古细菌群落结构和多样性变化进行了深入的研究。变性梯度凝胶电泳结果表明，发酵启动期、发酵稳定期和发酵结束期的细菌DGGE条带多样性完全不同。整个发酵过程中，有些优势条带随着发酵时间的延长表现为亮度增强，相反有些则减弱，这个结果体现出了细菌结构和多样性的变化。DGGE条带回收后进行测序分析，构建相应的系统进化树，分析沼气发酵过程各个时期的细菌和古细菌的变化规律。我们发现发酵过程中所检测到的微生物与未培养细菌有较高的同源性。整个发酵过程中，细菌的优势类群为Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria，其中Firmicutes主要属于Bacilli和Clostridia两个属，另外还检测到了Spirochaetes的活性，这些菌群在发酵过程中起到了重要的作用。在古细菌方面，检测到的产甲烷菌主要为甲烷微菌纲和甲烷杆菌纲，其中以Methanosaetaceae为优势群落，此外则是Methanosarcinales和Methanomicrobiales，另外还检测到了厌氧反应器中较少见的不产甲烷的泉古菌门的热变形菌。
　　 本实验初步比较了牛粪和猪粪沼气发酵的特性，分析了猪粪发酵过程中优势微生物群落的变化规律，为最终驯化沼气发酵过程中的优势微生物菌群，提高沼气能源的利用打下了扎实的基础，具有重要的理论意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号与缩写说明

声明

第一章 前言

1.1沼气发酵微生物研究进展

1.1.1沼气发酵微生物

1.1.2沼气发酵过程

1.1.3沼气发酵微生物之间的生态关系

1.2影响沼气发酵的主要因素

1.2.1接种物

1.2.2发酵原料

1.2.3 pH值

1.2.4原料浓度

1.2.5厌氧环境

1.2.6发酵温度

1.3沼气发酵技术的发展现状及研究进展

1.3.1国外沼气利用研究情况

1.3.2国内沼气利用研究情况

1.4微生物分子生态学研究技术

1.4.1标记核酸探针杂交技术

1.4.2以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法

1.5研究目的与意义

第二章 材料与方法

2.1菌株和质粒

2.2培养基、培养条件和常用抗生素

2.2.1培养基

2.2.2培养条件

2.2.3菌种保存

2.2.4抗生素

2.3溶液、缓冲液和试剂

2.4所用仪器

2.5质粒DNA的制备

2.5.1碱变性法小量提取质粒DNA

2.5.2试剂盒提取质粒

2.6质粒DNA的纯化、沉淀与贮存

2.7琼脂糖凝胶电泳

2.8样品总DNA的提取与纯化

2.8.1样品总DNA的提取

2.8.2电洗脱法纯化回收DNA片段

2.9 PCR扩增

2.9.1细菌16S rDNA V3区的扩增

2.9.2古细菌16S rDNA片段的扩增

2.10 E.coli感受态细胞的制备

2.11 DNA的连接

2.12质粒DNA的转化

2.13 PCR扩增产物的DGGE分析

2.13.1样品的制备

2.13.2 DGGE相关溶液的制备

2.13.3 DGGE凝胶的制备

2.13.4点样及电泳

2.13.5 DGGE凝胶的染色方法

2.13.6 DGGE条带回收方法及序列分析

2.13.7系统进化分析

2.14沼气发酵罐的建立与样品的采集

2.14.1发酵基质

2.14.2沼气发酵模拟装置的建立

2.14.3发酵条件

2.14.4样品采集

2.15沼气产量的测定

2.16沼气中甲烷含量的测定

2.17发酵液pH值的测定

2.18发酵原料总固体含量及总挥发性固体含量的测定

2.19总碳(TC)、总氮(TN)的测定

第三章 沼气发酵过程中的物质变化及产气规律

3.1实验室条件下沼气发酵模拟装置的建立

3.2发酵过程中pH值的变化

3.3发酵过程中沼气产量及甲烷含量变化规律

3.4发酵过程中总固体、挥发性固体、总碳、总氮、碳氮比的变化

3.5 小结

第四章 厌氧发酵过程细菌和古细菌16S rDNA的DGGE分析

4.1 DGGE分析猪粪沼气发酵过程微生物群落多样性

4.1.1样品总DNA的提取和纯化

4.1.2细菌16S rDNA V3可变区DNA片段的扩增

4.1.3古细菌16S rDNA片段的扩增

4.1.4变性梯度凝胶电泳分析微生物群落多样性

4.2序列登录号

4.3 小结

第五章 总结与讨论

5.1沼气发酵过程中产气量及发酵理化特性的分析

5.2沼气发酵过程中细菌多样性变化分析

5.3沼气发酵过程中古细菌多样性变化分析

5.4总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况

附录