发酵木糖产乙醇真菌的分离鉴定及产乙醇代谢持性的研究

摘要

木糖是纤维素质的主要组分,其在自然界中的储量仅次于葡萄糖,分离筛选能发酵木糖产乙醇的微生物对纤维素质乙醇的生产具有重要意义。本研究采用以木糖作为唯一碳源的富集和分离方法从采集的土样中分离纯化到能利用木糖的酵母样真菌207株,通过发酵木糖产乙醇的性能和发酵葡萄糖产乙醇的性能测定,从中筛选到两株乙醇生产性能良好的发酵木糖酵母菌XY-19和GX-15。XY-19经形态鉴定及18SrDNA序列和ITS序列在NCBI数据库上的比对结果被鉴定为Candidatropicalis,并命名为C.tropicalisXY-19,GX-15经形态鉴定及26SrDNA的D1/D2区序列在NCBI数据库上的比对结果被鉴定为Kluyveromycesmarxianus,并命名为KmarxianusGX-15。
　　 XY-19菌株的最适乙醇发酵温度为32℃,最适乙醇发酵pH为4.0。发酵动力学研究表明,C.tropicalisXY-19发酵葡萄糖的性能与我国乙醇工业生产所用的安琪酒精酵母相似,其μmax、VS、VP、VP/S分别为0.11h-1、2.12g/1·h、1.11g/1·h和0.47g/g。和其它己报道的发酵木糖酵母菌株一样,XY-19也是通过XR-XDH代谢途径代谢木糖,其木糖还原酶以NADPH为辅酶,而木糖醇脱氢酶以NAD+为辅酶,XR和XDH活力比比较高,为3.4。木糖能诱导XY-19的XDH大量表达,而葡萄糖不能诱导XY-19的XDH的表达。XY-19需要在有氧条件下才能利用木糖,其利用木糖的能力比利用葡萄糖的能力差,在有氧条件下葡萄糖的消耗速度VS为3.02g/1·h,而木糖的消耗速度VS只有0.73g/1·h,木糖的利用受到葡萄糖的抑制,发酵木糖时积累大量的木糖醇。XY-19的乙醇耐受性比酿酒酵母差,在超过7％(v/v)的乙醇中不能生长。经过4轮genomeshuffling结合木糖乙醇梯度平板的筛选,获得了4株(G3-13、G3-18、G3-57和G3-60)能够在12％乙醇平板上生长的菌株,其乙醇耐受性比野生菌株XY-19提高了71％。
　　 K.marxianusGX-15乙醇发酵的最适温度为40℃,最适发酵pH为4.0。在超过9％(v/v)的乙醇中不能生长。发酵葡萄糖产乙醇的动力学研究表明,GX-15具有良好的乙醇发酵性能,其μmax、VS、VP、YP/S分别为0.11h-1、1.78g/1·h、0.76g/1·h和0.43g/g。采用两轮紫外线照射—亚硝基胍诱变交替处理的复合诱变方法对KmarxianusGX-15进行诱变,结合TTC的筛选方法,获得了4株乙醇产量有提高的突变株,其中一株GX-UN120与GX-15相比,葡萄糖的消耗速率VS提高了38％,比生长速率μmax提高了18.2％,乙醇生成速率VP提高了26.3％,乙醇产量提高25.2％,乙醇耐受性从9％提高到11％。
　　 采用以木糖作为唯一碳源的厌氧富集和厌氧分离方法从采集的土样中分离纯化到一株能在厌氧条件下利用木糖生长的霉菌XE-1。经形态鉴定及18SrDNA序列、ITS序列和D1/D2区序列在NCBI数据库上的比对结果,该霉菌初步鉴定为Pestalotiopsis属的一个种,命名为Pestalotiopsissp.XE-1。该菌株能够发酵木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉生成乙醇,最适发酵温度和最适生长温度都为30℃,最适发酵pH为6.5,能耐受6％的乙醇。能够在100g/1木糖浓度下生长、发酵生成乙醇,与其它已报道的木糖发酵微生物菌株相比其木糖耐受浓度比较高。经木糖代谢关键酶的研究发现,虽然XE-1也是通过XR-XDH代谢途径代谢木糖,但是XE-1的木糖还原酶的辅酶偏好性和其它木糖利用真菌不同。该菌的XR既可以以NADPH为辅酶,也可以以NADH为辅酶,而且对NADH的亲和力高于NADPH,以NADH为辅酶的XR活力比以NADPH为辅酶的活力高68％,这是迄今报道的第二个具有对NADH的亲和力高于NADPH的XR的微生物。XE-1的XR和XDH活力的比例比较低,为0.43(XR以NADPH为辅酶)或1.13(XR以NADH为辅酶)。木糖和葡萄糖都能诱导XE-1的XDH的表达。XE-1的XR辅酶偏好和XR和XDH活力的低比例很好地解释了为什么该菌在发酵木糖过程中不积累任何木糖醇、在厌氧条件下也能发酵木糖产生乙醇。在已研究的木糖利用真菌中,能够在厌氧条件下发酵木糖产生乙醇、在发酵木糖过程中不积累任何木糖醇的真菌是非常少见的。
　　 通过溶氧对XE-1发酵木糖产乙醇的影响的研究表明,虽然XE-1能够在厌氧条件下发酵木糖生成乙醇,但溶氧对XE-1发酵木糖产乙醇的影响还是比较大的,在好氧和半好氧条件下,XE-1分别在96h和84h将20g/1木糖全部消耗完,在微好氧和厌氧条件下只能缓慢利用木糖,120h后只分别利用了75％和48％的木糖。半好氧条件下利用木糖的速度最快,乙醇产量最高,达4.1g/1,而在好氧、微好氧和厌氧条件下的乙醇产量分别只有半好氧条件下的80％、78％和41％。发酵木糖生成乙醇的过程中的主要副产物是乙酸,没有木糖醇的积累,发酵过程中产生的乙酸会导致发酵液的pH下降,在不进行pH控制的情况下,生物量、木糖的消耗速度、乙醇产量均明显下降。