发酵木糖产乙醇细菌的筛选及发酵特性研究

摘要

随着世界人口的迅猛增长以及世界经济的发展、生活水平的提高，能源危机、环境问题以及粮食短缺问题日益困扰着整个世界。寻求新的可再生清洁能源，缓解环境危机和粮食危机则显得越发重要。燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。以木质纤维素类生物质生产燃料乙醇不仅能够降低燃料乙醇生产的原料成本，同时在废物处理、环境保护等方面起到一定的作用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一。因此，木糖利用率和高耐抑制物能力的木糖发酵菌种的选育一直是该领域的热门课题。
　　本论文以微生物学的理论为基础，根据木糖发酵菌的生活环境特点，从大熊猫粪便中分离筛选出一株发酵木糖产乙醇的菌株FZ12-N，应用菌株的生理生化特性、微生物细胞膜短链脂肪酸特异性分析和16SrDNA分子生物学手段对该菌株进行了鉴定，结果为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。该菌有广泛的碳源，能以多种戊糖、己糖为碳源，并且能以木糖为惟一碳源乙醇发酵，且有较高的产率。
　　对影响FZ12-N发酵的营养物质和发酵条件进行了研究。将氧对发酵的影响进行简单对比研究发现，FZ12-N在限氧条件下乙醇产量明显高于好氧发酵和厌氧发酵，所以本研究采用限氧性发酵。确定发酵培养基中的氮源，结果表明，有机氮源酵母浸膏和蛋白胨有利于发酵，其效果明显优于(NH4)2SO4等无机氮源。确定FZ12-N液体发酵条件是：温度35℃，pH6.3，摇床转速130r/m，发酵时间72h。在此最优条件下FZ12-N发酵液中的乙醇浓度可达45.26mmol/L，是木糖发酵理论产率的27.39％。
　　对FZ12-N木糖发酵产物进行了分析，并恒算了发酵的碳平衡。以木糖为惟一碳源液体发酵，以12h为时间单位取样，测定发酵液中的小分子产物产量，分析发酵规律，简单解析发酵途径。结果显示FZ12-N木糖发酵有多种副产物，主要有乙酸，2,3-丁二醇，乙偶姻等，所以在FZ12-N代谢过程中有多种代谢支路存在。FZ12-N主要代谢支路有PPP途径，TCA循环，乙醇支路，乙酸支路，乙偶姻支路，2,3-丁二醇支路，甲酸支路，乳酸支路等，并建立碳流向分配模型。对发酵过程的碳平衡恒算，碳回收率达到81.75％，其中合成乙醇的碳素量占碳消耗量的21.10％。
　　以葡萄糖和木糖2:1的比例进行混合糖发酵研究，结果表明，FZ12-N有明显的葡萄糖效应，葡萄糖更易于被菌体利用，但是乙醇产率没有明显升高。
　　通过木糖发酵细菌菌株的筛选，鉴定，确定了发酵条件及对发酵产物进行了分析，建立了木糖乙醇发酵的碳流向数学模型，为细菌乙醇发酵提供了大量的基础数据，对未来工作有重要的积极意义。

目录

发酵木糖产乙醇细菌的筛选及特性研究

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 课题的研究背景

1.2 木糖代谢微生物

1.2.1 能发酵植物纤维原料生成乙醇的微生物

1.2.2 能发酵木糖生成乙醇的微生物

1.3 木糖的代谢途径

1.4 木糖发酵菌株的选育

1.4.1 从自然界中继续筛选戊糖发酵菌种

1.4.2 采用定向培育技术

1.4.3 采用原生质体融合技术对菌株改造

1.4.4 采用代谢工程技术对发酵木糖菌株进行改良

1.5 有待研究的问题及有用前景

1.6 本课题的研究来源及主要研究内容

1.6.1 课题来源

1.6.2 主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验主要仪器

2.2 实验采用的培养基

2.2.1 富集培养基

2.2.2 ManFels培养液

2.2.3 初筛培养基

2.2.4 液体发酵培养基

2.2.5 液体发酵培养基营养液

2.2.6 碳源利用实验培养基

2.3 理化分析项目和方法

2.4 微生物学分析项目和方法

2.4.1 微生物形态学观察

2.4.2 细菌生理生化分析

2.4.3 微生物细胞膜短链脂肪酸特异性分析

2.4.4 细菌的16S rDNA鉴定

第3章 发酵木糖产乙醇细菌的筛选及鉴定

3.1 发酵木糖产乙醇细菌的筛选

3.1.1 样品来源

3.1.2 富集培养

3.1.3 菌株初筛

3.1.4 菌株复筛

3.1.5 细菌的保藏

3.1.6 细菌生长曲线测定

3.2 细菌鉴定

3.2.1 细菌的群落形态及个体特征

3.2.2 细菌的生理生化性质

3.2.3 细菌的脂肪酸特异性分析

3.2.4 细菌的16S rDNA鉴定

3.3 本章小结

第4章 木糖发酵菌株的发酵条件确定及碳流向分析

4.1 发酵条件确定

4.1.1 供氧条件的确定

4.1.2 摇床转速确定

4.1.3 氮源确定

4.1.4 接种量确定

4.1.5 温度确定

4.1.6 pH确定

4.1.7 发酵时间确定

4.2 FZ12-N的木糖乙醇发酵过程中碳流分配研究

4.2.1 木糖发酵产物分析

4.2.2 木糖发酵碳平衡分析

4.2.3 木糖发酵过程碳流向分析

4.2.4 木糖发酵过程碳流分配数学模型

4.3 葡萄糖木糖混合糖发酵

4.3.1 葡萄糖木糖发酵产物分析

4.3.2 单糖发酵与混合糖发酵对比分析

4.4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

哈尔滨工业大学硕士学位涉密论文管理

致谢