一株利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌

摘要

发酵木糖产乙醇是利用生物质生产乙醇的关键技术之一。用代谢工程的方法构建了一株酿酒酵母工程菌。该菌株不仅能发酵木糖产乙醇，而且能自动平衡氧化还原辅因子，是一株副产物少、能高效利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌。该菌株发酵木糖产乙醇的转化率达到88％，为利用生物质生产燃料乙醇奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一株高效利用木糖发酵产乙醇的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌菌株E33及其应用。

背景技术

随着石油资源的日渐枯竭，乙醇作为清洁燃料已替代部分汽油，需求逐年增长。目前生产乙醇的原料主要是来自粮食的淀粉，原料成本占整个生产成本的一半以上，成为燃料乙醇大规模推广的一个瓶颈。生物质是地球上最丰富的可再生资源。利用生物质生产燃料乙醇是国际上竞相开发的热点。生物质中碳水化合物彻底降解成单糖后有近三分之一是木糖，高效转化木糖生产乙醇不仅环保而且有利于降低成本。酿酒酵母广泛应用于大规模乙醇发酵工业，但其不能利用木糖，因此许多科学家企图构建能发酵木糖的酿酒酵母工程菌。通常的构建方法是将外源木糖还原酶、木糖醇脱氢酶(来自毕赤酵母(Pichia stipitis))基因在酿酒酵母中异源表达，同时过量表达内源木酮糖激酶(来自酿酒酵母)。这样的重组酿酒酵母能够低效率地发酵木糖产乙醇(Kuyper等，FEMS YeastResearch，4：655-664，2004)，同时分泌大量的副产物木糖醇。由于木糖发酵过程中重组酿酒酵母细胞中毕赤酵母来源的木糖还原酶优先利用还原型辅酶II而木糖醇脱氢酶只能特异性利用氧化型辅酶I，导致了还原型辅酶II枯竭和还原型辅酶I的积累。氧化还原辅酶的不平衡造成了木糖利用率低和木糖醇的积累，目前国内外构建的工程菌在发酵木糖产乙醇时，木糖对乙醇的转化率较低(Gnansounou等，Bioresource Technology，96：985-1002，2005)，这问题已成为生物质发酵产乙醇的技术关键。

发明内容

本发明的目的是提供能够高效利用木糖发酵产乙醇的工程菌，及其利用生物质发酵产乙醇的应用。

在本发明的一个方面，提供了一株新的利用木糖发酵产乙醇的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E33工程菌菌株，所述菌株于2006年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC No.1746。

在本发明的又一个方面，提供所述酿酒酵母E33工程菌菌株利用木糖发酵产乙醇的应用。

与现有技术比较，该工程酵母菌的特点是不仅具有来自假丝酵母的辅酶II特异性木糖还原酶活性，而且还有可溶性转氢酶活性。在木糖发酵过程中能自动再生辅酶保持辅酶平衡，因此能高效利用木糖发酵产乙醇，木糖对乙醇的转化率达到88％，为利用生物质生产燃料乙醇奠定了基础。

附图说明

图1是酵母载体pY2(a)和pGH3(b)的物理性图谱。

图1(a)pADH1：醇脱氢酶(ADH1)启动子；tADH1：ADH1终止子；pGPD1：甘油3磷酸脱氢酶启动子；tCYC1：细胞色素c等位1终止子；XDH：来自毕赤酵母的木糖醇脱氢酶的基因；URA3(尿嘧啶)和LEU2(亮氨酸)：酵母选择标记；

图1(b)ADH1p：醇脱氢酶(ADH1)启动子；ADH1t：ADH1终止子；GPD1p：甘油3磷酸脱氢酶启动子；CYC1t：细胞色素c等位1终止子；CmXYL1：来自麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的编码木糖还原酶的基因；XKS1：来自酿酒酵母的编码木酮糖激酶的基因；udhA：来自大肠杆菌(E.coli)的编码转氢酶的基因；LEU2：酵母选择标记

本发明所构建的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌菌株E33已于2006年6月28日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心地址为北京市海淀区中关村北一条13号。保藏号为：CGMCC No.1746。

以下是几个实施例，参考下列实施例可以更好地理解本发明。这些实施例意味着本发明具体实施方案的体现，但不限制本发明的范围。

实施例

实施例中所用的载体除另有说明之外，均购自Invitrogene公司。

实施例一 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E33工程菌的构建

酿酒酵母W303-1Bα(Pearce，A.K.等：Micobiology 147，391-401.，2001)作为构建工程菌的出发菌株。在构建过程中所用到的菌株还包括毕赤酵母CBS 6054(Wahlbom，C.F.等：FEMS Yeast Res 3，319-26.，2003)，麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316(C.Guo，等：J.Appl.Microb.101，139—150，2006)和大肠杆菌(E.coli)JM109(Invitrogene)。根据标准方法(Ausubel，F.M.，等：Current protocols in molecular biology.Wiley，Toronto，1987)分别提取酵母毕赤酵母CBS 6054，酿酒酵母W303-1Bα、麦芽糖假丝酵母XU316和大肠杆菌E.Coli JM109基因组DNA。以毕赤酵母CBS 6054基因组DNA为模板，利用引物

Pxdhs(5′-GCAGGATCCATGACTGCTAACCCTTCCTTG-3′)和

Pxdha(5′-GCACTCGAGTTACTCAGGG CCGTCAATGAG-3′)

PCR扩增，

PCR混合液：

(1)模板DNA：       1μl(10ng)

(2)引物Pxdhs：     1μl(10mM)

(3)引物Pxdha：     1μl(10mM)

(4)dNTPs：         1μl(10mM)

(5)Taq DNA聚合酶： 0.5μl(5U/μl)

(6)10×缓冲液：    5μl

(7)重蒸水：        40.5μl

PCR条件：94℃变性5min后开始以下循环，94℃变性反应30sec；55℃退火反应30sec；72℃延伸反应1min；进行30个循环；最后72℃反应5min；4℃冷却恒定。得到其木糖醇脱氢酶基因(PsXYL2)。将木糖醇脱氢酶基因(PsXYL2)克隆到表达载体pRUL129(van den Berg，M.A.和Steensma，H.Y.1997.Yeast 13，551-559.)上从而使其获得酿酒酵母组成型表达启动子GPD1和CYC1终止子。将该表达盒：启动子GPD1，PsXYL2的ORF和CYC1终止子进一步克隆到多拷贝整合质粒pSAK068中，得到质粒pY2。该质粒以ura3(尿嘧啶)为选择性标记。以麦芽糖假丝酵母XU316基因组DNA为模板，利用引物

Pxrs(5′-GCAGGATCCATGACTACTTCTTCTACTATT-3′)和

Pxra(5′-GCACTCGAGTTAAACGAAAATTGGAATGTTGTC-3′)PCR扩增，得到其木糖还原酶基因(CmXYL1)。以酿酒酵母W303-1Bα基因组DNA为模板，利用引物Pxks(5′-GCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGACAG-3′)和Pxka(5′-CGGTCGACGCTACAGTATACGAAACATACAAGG-3′)PCR得到扩增其木酮糖激酶基因(ScXKS1)。同样分别将外源的木糖还原酶基因(CmXYL1)以及内源的木酮糖激酶基因(ScXKS1)克隆到表达载体pRUL129上，使其获得真核表达所需要的启动子GPD1和CYC1终止子。通过DNA重组技术构建两个基因串联表达的共表达盒(启动子GPD1，CmXYL1和终止子CYC1，启动子GPD1，ScXKS1和终止子CYC1)。新型的2μ型表达载体pGH，来自克隆载体pbluescript SK(Invitrogene)和表达载体pAD-GAL4-4.1(Invitrogene)并以leu2为选择性标记。以E.Coli JM109基因组DNA为模板，利用引物Pths(5′-AGGGATTCCATGCCACATTCCTACGATTAC-3′)和Ptha(5′-CCCTCGAGTTAAAACAGGCGGTTTAAACC-3′)PCR扩增得到其可溶性的转氢酶基因(udhA)。转氢酶基因(udhA)被克隆在2μ型表达载体pGH上。同时插入上述木糖还原酶基因(CmXYL1)木酮糖激酶基因(ScXKS1)共表达盒，形成质粒pGH3。用LiAc酵母转化方法(Gietz，R.D.，等，Yeast，11：355-360，1995)，将质粒pY2转化受体菌S.cerevisiae W303-1Bα。在尿嘧啶缺陷的SC选择性培养基(0.67％，酵母氮碱；2％，葡萄糖；1.5％，琼脂，适量的腺嘌呤和必需氨基酸(亮氨酸，组氨酸，色氨酸))上筛选得到携带木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母菌株E3。以重组酿酒酵母菌株E3为受体菌，转化(LiAc酵母转化方法(Gietz，R.D.，等，Yeast，11：355-360，1995))质粒pGH3，在尿嘧啶和亮氨酸缺陷的SC选择性培养基(0.67％，酵母氮碱；2％，葡萄糖；1.5％，琼脂，适量的腺嘌呤和必需氨基酸(组氨酸，色氨酸))上筛选得到酿酒酵母E33工程菌菌株。

实施例二，酿酒酵母E33工程菌的木糖还原酶和转氢酶活性

重组工程菌E33和出发菌株W303-1Bα分别接种于5ml的SC培养基(0.67％，酵母氮碱；2％，葡萄糖；适量的必需氨基酸(组氨酸，色氨酸))中，培养(30℃，250rpm摇床培养)过夜。出发菌株W303-1Bα做为对照。离心(5000rpm，3分钟)收集菌体。利用玻璃珠法(《酵母遗传学方法实验指南》，87-88)裂解细胞，高速离心(13000rpm，40分钟)收集蛋白上清。根据Bruinenberg所描述的测定方法(Bruinenberg，P.M.，等，J.Gen.Microbiol.，129：953-964，1983)测定细胞抽提物中的木糖还原酶和转氢酶比活力。在出发菌株W303-1Bα中只检测到微弱的辅酶II相关的木糖还原酶活性，没有检测到转氢酶活性。酿酒酵母E33由于引入了假丝酵母的木糖还原酶基因(CmXYL1)和细菌的转氢酶基因(udhA)具有了明显的木糖还原酶活性(0.251U mg^-1，特异性以辅酶II为辅酶，检测不到辅酶I相关的酶活性)和转氢酶活性(6.288U mg^-1)。木糖还原酶活性单位定义为每分钟催化还原1mmol木糖时所需要的酶量；转氢酶活性单位定义为每分钟催化还原1nmol tNAD的酶量。

实施例三，酿酒酵母E33工程菌菌株发酵木糖产乙醇

重组工程菌菌株E33接种于装在250ml摇瓶中的100ml YPD培养基(酵母抽提物10g l^-1；胰蛋白胨20g l^-1；葡萄糖20g l^-1)中。30℃，250rpm摇床培养24小时。离心收集菌体(5000rpm，5分钟)，用等体积的0.9％生理盐水洗涤细胞两次。细胞重悬于装在250ml摇瓶中的100ml YPX培养基中(酵母抽提物10g l^-1；胰蛋白胨20g l^-1；木糖30g l^-1)，于30℃、100rpm摇床培养。84小时后取样测得消耗木糖的浓度为22.2g l^-1，乙醇的浓度为9.0g l^-1，木糖对乙醇的产率为0.405g g^-1，转化率为88％。