嗜热栖热菌Thermus sp.WG内源质粒的分离、鉴定及序列分析

摘要

Thermussp.WG为本实验分离鉴定的嗜热栖热属菌株。16SDNA分析与ThermusthermophilusHB8同源性达98％，但16S-23SITS分析为不同菌株。最适生长温度75℃，最适pH值为7.0。能够抗链霉素、四环素、氯霉素。氨苄青霉素和卡那霉素对它有抑制作用。在其中发现了3个染色体外DNA，分子量大小分别约为28kbp、16kbp及13kbp。经Southern杂交鉴定为独立于染色体外的复制元件。推测其为内源性质粒，分别命名为pWG28、pWG16和pWG13。
　　 通过改进的碱裂解法提取了Thermussp.WG内源性质粒DNA。实验表明质粒DNA能转化到大肠杆菌JM109和XL-10Goldern中，在涂布了100ug/ml的链霉素LA平板上能生长。部分限制性内切酶能将Thermussp.WG内源性质粒DNA降解成特异大小的条带。将酶切产物与经过同样限制型内切酶处理的克隆载体连接，转化到大肠杆菌JM109中，分别构建了BamHI、PstI、EcoRI-NcoI、HindⅢ-NcoI四套亚克隆库，共获得250个阳性克隆子，外源插入片段范围为约0.75bp-12kbp。
　　 测序获得的亚克隆子序列经Cap3自动化拼接和手工拼接得到大片段。其中，一个15957bp的片段为完整的环状质粒片段，Southern杂交对应pWG16;一个12481bp的片段为剩余一个缺口的质粒片段，Southern杂交对应pWG13;一个6878bp的片段Southern杂交显示为pWG28上的片段。序列分析分别得到16、23、8个可能的ORF并进行了相似性比对、基因预测和进一步注释。获得了3个质粒复制起始蛋白基因，分别命名为rep28、rep16以及rep13。氨基酸序列多重序列比对及进化树分析表明：Repchrom、Rep13进化距离与类大肠杆菌质粒复制蛋白ColE-2的形式复制的pTT8复制蛋白更接近；Rep16、Rep28则与嗜热菌噬菌体的复制起始蛋白进化距离较近。
　　 根据染色体上单拷贝的管家基因gapdh和质粒上的复制起始蛋白基因分别设计引物，实时荧光定量PCR测定了质粒pWG16相对于染色体的拷贝数，为4.82±1.01。