水牛胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性的研究

摘要

水牛是中国南方地区较为重要的一种家养动物，在农业耕作上一直将其作为劳力使用。近些年来随着对水牛研究的不断深入，其经济利用价值逐渐显现出来，特别是将其作为生物反应器生产目的蛋白。目前尚未建立生物学特性明确的水牛细胞系，限制了在细胞水平研究和长期保存水牛种质资源，也妨碍了通过将稳定表达外源基因的细胞作为核移植供体，获得基因改造水牛的研究。因此，建立水牛细胞系并对其进行生物学特性的研究非常重要。
　　 从南宁市内屠宰场获取88只水牛胎儿，对其耳缘、肾脏、皮肤进行原代培养，从分离获得的成纤维细胞中挑选出形态正常、生长动力学较好的细胞系，最后挑选出2个水牛胎儿皮肤成纤维细胞系(BFSF101107、BFSF101007)、1个水牛胎儿耳缘成纤维细胞系(BFEF)、1个水牛胎儿肾脏成纤维细胞系(BFKF)、1个水牛胎儿肾脏扁平状成纤维细胞系(BFKF-Flat)。然后对这些细胞系分别进行生长动力学测定、冻存前/复苏后活率测定、微生物污染检测、核型分析、同工酶检测、荧光蛋白转染效率、细胞周期分析。这5个细胞系生长动力学测定结果所绘制的生长曲线都为“S”型；细胞冻存前、复苏后都具有较高的活率；微生物污染检测的结果均为阴性。对这些细胞系进行核型分析和同工酶分析检测是否存在细胞交叉污染，结果显示这些细胞绝大多数含有48条染色体(20代)，同工酶电泳图谱显示细胞系之间没有交叉污染。相同转染条件下，在绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的表达效率上BFSF101107的最高，在表达强度上BFKF-Flat的最强。接着，对各细胞系第20代细胞进行细胞周期分析，结果BFSF101107与他细胞系相比，细胞之间染色体均一性好、畸变概率低。因此，基于细胞的后续研究可以依据这些细胞系的不同生物学特性进行相应的选择。
　　 在无抗生素条件下，成功建立了2个水牛胎儿皮肤成纤维细胞系(BFSF101107、BFSF101007)、1个水牛胎儿耳缘成纤维细胞系(BFEF)、1个水牛胎儿肾脏成纤维细胞系(BFKF)、1个水牛胎儿肾脏扁平状成纤维细胞系(BFKF-Flat)，并成功将各细胞系传至第30代。从各细胞系检测指标上来看，皮肤来源的成纤维细胞要优于其他组织来源的，本研究的结果为其他大型动物成纤维细胞系的建立提供了参考。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

1.1 水牛简介(起源、分类及分布)

1.2 水牛相关研究的进展

1.2.1 水牛核移植

1.2.2 转基因水牛

1.2.3 水牛干细胞

1.3 动物组织体外培养简介

1.3.1 细胞培养的探索阶段

1.3.2 培养技术的高速发展、成熟阶段

1.3.3 细胞大量培养技术的应用

1.4 成纤维细胞简介及研究进展

1.4.1 耳部成纤维细胞

1.4.2 皮肤成纤维细胞

1.4.3 肾脏成纤维细胞

1.5 细胞系建立所需生物学相关特性的检测

1.5.1 细胞生长曲线和细胞活率的测定

1.5.2 微生物污染检测

1.5.3 核型分析

1.5.4 同工酶检测

1.5.5 细胞转染效率

1.6 细胞系的具体应用

1.6.1 在生命科学研究方面的应用

1.6.2 医学方面的应用

1.6.3 农业方面的应用

1.6.4 生物制品的生产

1.7 本研究的主要目的、内容和意义

1.7.1 主要目的

1.7.2 主要内容

1.7.3 主要意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 设备

2.1.2 水牛胎儿

2.1.3 质粒与引物

2.1.4 培养基与试剂

2.1.5 其他试剂

2.2 细胞学操作

2.2.1 原代组织块培养

2.2.2 细胞分离、纯化

2.2.3 细胞传代、冻存、复苏

2.2.4 细胞生长曲线测定

2.2.5 细胞活率测定

2.3 分子生物学操作

2.3.1 PCR法检测支原体

2.3.2 细胞类型的免疫组化检测

2.3.3 细胞转染

2.4 生物化学操作

2.4.1 同工酶检测

2.4.2 核型分析

2.4.3 细胞周期检测

2.4.4 Hoechst 33342染色法检测支原体

2.5微生物学操作

2.5.1 细菌、真菌检测

2.5.2 病毒检测

第三章 试验结果与分析

3.1 原代组织块培养所获得的细胞系

3.1.1 原代组织块培养

3.1.2 细胞消化、传代

3.2 各细胞系细胞类型鉴定

3.3 各细胞系生长曲线

3.4 各细胞系冻存活率

3.5 各细胞系微生物检测

3.5.1 真菌、细菌检测结果

3.5.2 支原体检测结果

3.5.3 病毒检测结果

3.6 各细胞系同工酶检测结果

3.6.1 乳酸脱氢酶(LDH)检测结果

3.6.2 苹果酸脱氢酶(MDH)检测结果

3.7 各细胞系核型分析结果

3.8 各细胞系细胞周期分析

3.9 各细胞系转染效率测定

第四章 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 原代培养材料的选择

4.1.2 微生物污染及细胞的无抗培养

4.1.3 细胞培养体系

4.1.4 细胞操作的优化

4.1.4 细胞生长动力学特性

4.1.5 细胞多倍体的产生

4.1.6 核型分析及同工酶检测

4.1.8 细胞转染体系的优化

4.1.9 细胞周期分析

4.2 结论

4.3 展望

附章 水牛诱导多能干细胞(iPSCs)的初步研究

附.1 研究意义、目的

附.2 试验材料和方法

附.2.1 试验材料

附.2.2 试验方法

附.3 部分试验结果

附.3.1 质粒PCR验证

附.2.2 慢病毒包装体系的优化

附.3 分析及讨论

附.3.1 慢病毒包装体系的优化

附.3.2 慢病毒感染细胞

附.4 本章试验进展总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况