甜高粱蔗糖合成酶基因的克隆及转EPSPS基因研究

摘要

甜高粱既能收获粮食，又能获得含糖茎秆，且其耐旱、耐盐碱不与粮食作物争地的特点使其成为中国生物质能源的良好选择。但其作为生物质能源仍存在一些亟待解决的问题:茎秆含糖量不高，对除草剂敏感不利于降低生产成本等，对光敏感不利于其两季种植的高产等。本实验基于以上目的进行了3部分实验:1.克隆甜高粱北甜三号的蔗糖合成酶基因及其前端调控序列;2.建立北甜三号再生转化体系;3.转抗除草剂基因EPSPS。主要结论如下:
　　 1.北甜三号蔗糖合成酶序列与分析。经序列分析可知:此序列共计5992bp，起始密码子至终止密码子共4483bp，共编码802个氨基酸。经由比对后发现该序列与NCBI上已登录甜高粱品种AFRICA WHITE的蔗糖合成酶编码序列相似度达97％，说明了蔗糖合成酶基因具有保守性;
　　 2.北甜三号再生转化体系。不同基因型的甜高粱品种，其诱导胚性愈伤组织与分化的配方也大相径庭。经实验与后期数据分析可知，北甜三号最佳诱导胚性愈伤组织培养基为:MS+2.5mg/L2，4-D+0.1mg/LTDZ;最佳诱导分化培养基为:MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA;
　　 3.转抗除草剂基因EPSPS。经实验发现如果农杆菌浸染时间过长，在后期共培养过程中会大量出现胚性愈伤组织褐化死掉现象;侵染时间如果过短，在后期筛选胚性愈伤组织时会发现大量假阳性。在浸染晃荡过程中，较易松散的颗粒状胚性愈伤组织在后期共培养过程中更容易存活;得出最佳共培养时间为60小时，且筛选过程中较适宜的抗生素浓度第1周为50ug/ml卡纳霉素、75mg/ml潮霉素和500mg/L羧苄青霉素，第2周为50ug/ml卡纳霉素、37.5mg/ml潮霉素和250mg/L羧苄青霉素。

目录

声明

摘要

缩略词

1 前言

1．1 生物质能源作物概况及我国发展生物质能源的合理选择

1．1．1 生物质能源作物种类及优势

1．1．2 国内外生物质能源作物的研究利用现状

1．1．3 在中国发展生物质能源的合理选择

1．2 能源作物甜高梁的研究进展

1．2．1 甜高粱作为能源植物的特点

1．2．2 甜高粱作为生物质能源作物原料在工业化过程中存在的问题

1．3 蔗糖合成酶研究进展

1．4 植物转抗除草剂基因研究进展

1．4．1 抗除草剂基因及其作用机制

1．4．2 转抗除草剂基因作物研究进展

1．4．3 甜高粱再生体系研究进展

1．5 本研究目的、意义及创新点

2 北甜三号蔗糖合成酶基因克隆

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 质粒与菌株

2．1．3 酶、试剂和培养基

2．1．4 实验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 甜高粱基因组DNA

2．2．2 PCR结果

2．2．3 序列测定与分析

2．3 讨论

3 甜高粱品种北甜三号再生转化体系的建立

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果与分析

3．2．1 不同浓度配比的2,4-D与NAA对北甜三号愈伤组织诱导的影响

3．2．2 不同浓度配比的2,4-D与NAA对北甜三号胚性愈伤组织诱导的影响

3．2．3 不同浓度配比的2,4-D与TDZ对北甜三号愈伤组织诱导的影响

3．2．4 不同浓度配比的2,4-D与TDZ对北甜三号胚性愈伤组织诱导的影响

3．2．5 不同浓度配比的IAA与6-BA对北甜三号胚性愈伤组织分化率的影响

3．2．6 不同浓度配比的NAA与6-BA对北甜三号胚性愈伤组织分化率的影响

3．3 讨论

4 北甜三号农杆菌介导的转抗除草剂基因EPSPS

4．1 实验材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 质粒与菌株

4．1．3 酶和试剂

4．1．4 实验方法

4．2 实验结果

4．2．1 质粒双酶切鉴定结果

4．2．2 测序结果

4．2．3 甜高粱北甜三号愈伤组织的农杆菌介导转化筛选结果

4．3 讨论

5 全文结论

5．1 北甜三号蔗糖合成酶的克隆及序列分析

5．2 北甜三号再生体系的建立

5．3 农杆菌介导的转抗除草剂基因获得组培苗

5．4 问题与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间科研、学术活动、论文发表和专利发明等情况