酿酒酵母乙醇发酵工业菌株的RAPD分析与基因工程改造

摘要

甘蔗糖蜜作为我国南方蔗糖产区主要的乙醇发酵工业生产原料，具有低成本，不耗粮，并可解决制糖业污染等优点，对其乙醇发酵的研究一直是研究的重点，其中很关键的问题是获得高性能的菌种，菌株的鉴定及选育具有重要意义。因此本论文工作主要从两方面展开，首先选择单细胞形态及甘蔗糖蜜乙醇发酵表型不同的7株酿酒酵母工业菌株为研究对象，利用RAPD技术进行核基因组多态性分析鉴定，以探讨酿酒酵母核基因组多态性与相关性状的关系;然后以全基因组分析为基础进一步对菌株进行改造，以选育高性能的甘蔗糖蜜乙醇发酵酿酒酵母菌种。
　　 为满足实验进程要求，本实验建立了一种PCR模板高通量制备法，可以在3 min内完成一株酿酒酵母的PCR模板制备工作。ITS扩增及测序结果证实该法扩增目标条带的专一性。酿酒酵母不同长度核基因的扩增及RAPD扩增，证实该法相对于CTAB基因组法，具有时间短，操作简单等优势。
　　 基于PCR模板高通量制备法进行RAPD实验，先对22种随机引物进行筛选。利用8种引物对7株酿酒酵母工业菌株进行RAPD分析，结果表明，系列菌株间的相似性系数在0.47-0.96之间，高产菌株1015-04-01与高产菌株1002-03-03之间的相似性最高，而高产菌株1015-04-01与低产菌株1415相似性最低。利用UPGMA法进行聚类分析，高产菌株1016-02-04，低产菌株1415及低产菌株1313聚为一大类，而1415与1313又聚为一小类，其它4株高产菌株聚为另一大类。RAPD分析结果与系列菌株单细胞形态及产酒性状差异基本一致。
　　 分别以高产菌株1015-10-1，低产菌株1415作为基因改造对象与基因供体，进行基因工程改造，在PCR模板高通量制备基础上，筛选鉴定出突变子034-19。034-19菌株YFR034C基因的11、333等位点相对于对照1015-10-01发生突变，位点11及333的突变分别导致203位点的异亮氨酸变为缬氨酸，310位点的缬氨酸变为甘氨酸。相对于对照，突变子生长速度稳定加快，产气明显加快，蔗糖发酵培养基中最高酒度未见明显变化。在YPD培养基中，034-19生长速度加快，介于对照与1415之间，16 h达到最高浓度，6.36×108/mL;相对呼吸强度明显提高;糖蜜乙醇发酵加快，最高酒度14.52％，略高于对照的14.25％;碳源同化能力，糖蜜发酵糖利用能力未见明显变化。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 乙醇

1．2 乙醇的生产方法

1．2．1 化学合成法

1．2．2 发酵法

1．3 乙醇发酵的微生物菌种及乙醇发酵原料

1．3．1 乙醇发酵的微生物菌种

1．3．2 乙醇发酵原料

1．3．3 甘蔗糖蜜发酵生产乙醇

1．4 酿酒酵母分子鉴定

1．4．1 基于保守基因序列的鉴定

1．4．2 基于分子标记技术的鉴定

1．5 酿酒酵母基因组学研究

1．6 酿酒酵母基因工程改造

1．7 酿酒酵母分子鉴定与基因工程改造的技术基础

1．8 选题依据

1．9 技术路线

1．9．1 建立酿酒酵母PCR模板高通量制备法并进行验证

1．9．2 系列酿酒酵母工业菌株的RAPD分析

1．9．3 基因工程改造

第二章 方法与步骤

2．1 实验材料

2．1．1 酵母菌株

2．1．2 培养基与溶液配制

2．1．3 主要仪器设备

2．2 酶与试剂

2．3 PCR模板高通量制备法的建立与验证

2．3．1 利用PCR模板高通量制备法制备模板，扩增ITS

2．3．2 不同长度核基因扩增

2．3．3 CTAB法制备PCR模板，扩增不同长度核基因

2．3．4 2种方法RAPD扩增验证

2．4 酿酒酵母RAPD分析的方法与步骤

2．4．1 RAPD分析对象选择

2．4．2 RAPD引物

2．4．3 RAPD分析

2．5 高产菌株基因工程改造的方法与步骤

2．5．1 YFR034C基因的克隆验证

2．5．2 原生质体感受态制备

2．5．3 电转化及原生质体再生

2．5．4 菌株初步筛选

2．5．5 分子鉴定

2．5．6 突变子与对照发酵性状的初级比较

2．5．7 突变子发酵性状检测

第三章 结果与分析

3．1 PCR模板高通量制备法可行性对比验证

3．1．1 ITS序列扩

3．1．2 不同长度核基因扩增

3．1．3 CTAB提基因组法扩增不同长度核基因

3．1．4 2种方法RAPD扩增验证

3．2 系列酿酒酵母菌株的RAPD分析

3．2．1 RAPD分析对象选择依据

3．2．2 引物筛选

3．2．3 RAPD分析图谱选择

3．2．4 RAPD图谱统计

3．2．5 RAPD聚类分析

3．3 高产菌株基因工程改造

3．3．1 YFR034C基因扩增

3．3．2 菌株筛选及分子鉴定

3．3．3 突变子与对照发酵性状的初级比较

3．3．4 突变子发酵性状检测

第四章 讨论

4．1 酿酒酵母RAPD分析

4．2 酿酒酵母基因工程改造

4．3 PCR模板高通量制备法的建立

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录Ⅰ

培养基与溶液配制

主要仪器设备

附录Ⅱ

ITS序列

YFR034C基因

YFR034C基因编码的氨基酸序列

致谢

攻读学位期间发表的学术论文