基因工程与基因组重排技术构建酿酒酵母高效木糖发酵菌株及甘油发酵菌株

摘要

由于二氧化碳排放引起的气候变化和化石燃料日益枯竭,人类已经投入越来越多的精力于寻找替代能源。生物乙醇作为一种无污染的可再生能源,是极具前途的燃料替代品之一。利用粮食发酵生产乙醇的传统方法会造成粮食短缺,将生物柴油生产中的主要副产物甘油和工农业残余物中大量富含木糖的木质纤维素转化为乙醇成为当前的研究热点,对于解决环境以及能源问题有着重要的意义。
　　本实验以酿酒酵母saccharomyces cerevisiae工业菌株为出发菌进行了甘油利用及木糖代谢方面的研究。首先,我们在缺失甘油生成途径的LGE73菌株中整合编码NADH氧化酶的noxE基因调节细胞还原力,染色体重组过表达编码磷酸二羟丙酮激酶的DAK1、DAK2基因和甘油脱氢酶的GCY1基因。YPG平板培养显示noxE基因的整合对LGE73在甘油培养基中的生长有促进作用。RT-PCR测定显示DAK1,DAK2,GCY1的转录水平都得到了显著增强,但仍处于较低水平。甘油培养基中发酵实验表明,改造菌株需要经过长达144h的发酵才能利用16g/l的甘油,乙醇产量也只有0.6g/l。
　　我们在实验室已有木糖利用菌株KAM-6X中缺失了编码对硝基苯磷酸酶的PHO13基因,获得菌株KAM-6X(△PHO13),PHO13的缺失对木糖利用表现出积极作用,缺失菌株最大比生长速率为0.261h-1,可在48h耗掉50g/l的木糖,糖醇转化率增加到0.313g/g,木糖醇和甘油产量降低,而乙酸产量增加。我们还将新的有性重组介导的基因组重排方法应用于实验室原有木糖利用菌株KAM-6X(K270R)中,先将其转化为二倍体细胞,缺失编码α交配因子受体的STE2基因,进行EMS诱变、有性重组及进化工程筛选,获得木糖代谢能力显著增强的菌株WCY1。WCY1可在48h内消耗100g/l的木糖并达到0.395g/g的乙醇产率,最大比生长速率可达0.294h-1,这在现有文献报道的木糖发酵酿酒酵母菌株中位居前列。对WCY1进行混合糖发酵,显示木糖利用还是被葡萄糖抑制。测定木糖利用酶的酶活表明筛选获得了基因上有利于代谢木糖的突变而不是酶活的增加。验证进化后所得菌株的交配型证明菌株的构建同预期相符,结果表明我们选用的策略是一种有效的酿酒酵母木糖发酵菌株改造方法。

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第一章 文献综述

1.1 生物乙醇发展现状

1.2甘油的生物转化

1.3木糖-乙醇的生物转化

1.4 酿酒酵母利用木糖菌株构建

1.5 本文的研究背景、内容及目的

第二章 实验材料及方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 发酵过程的准备及结果分析方法

第三章 过表达甘油利用基因菌株构建及发酵性能分析

3.1 概述

3.2 质粒的构建

3.3 甘油利用菌株的构建

3.4 DAK1,DAK2,GCY1基因在酿酒酵母菌株中的实际转录强度测定

3.5 工程改造菌株的甘油发酵性能测试

3.6 本章小结

第四章 PHO13基因缺失对重组木糖发酵酿酒酵母的影响

4.1 概述

4.2 PHO13基因缺失质粒的构建

4.3 基因PHO13的缺失

4.4 PHO13基因缺失对KAM-6X发酵能力的影响

4.5 本章小结

第五章 有性重组技术改造酿酒酵母高效发酵木糖菌株

5.1 概述

5.2 KAM-6X(K270R)二倍体菌株中STE2基因缺失菌株的构建

5.3 菌株EMS诱变处理

5.4 有性重组介导的基因组重排

5.5 进化工程筛选

5.6 突变株的木糖发酵性能测试

5.7 突变株中XR,XDH,XKS的酶活测定

5.8 突变菌株交配型分析

5.9 本章小结

第六章 总结与展望

6.1 总结

6.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文和参加科研情况

致谢