表儿茶素对小鼠卵母细胞成熟质量的影响

摘要

本研究以小鼠为模型，通过探讨卵母细胞线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）拷贝数的变化以及卵巢抗氧化能力的强弱等，研究表儿茶素（Epicatechin，EC）对体外成熟（Matured in vitro，IVM）卵母细胞以及经重复超数排卵体内成熟卵母细胞成熟质量的影响，并进一步阐明线粒体DNA与卵母细胞发育潜能之间的关系，以及EC影响卵母细胞成熟的作用机制。
　　首先，探讨了表儿茶素对体外成熟小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数和发育潜能的影响。小鼠卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte Complexs，COCs）分别在添加不同浓度EC（0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，15μmol/L和20μmol/L）的成熟培养液中体外成熟培养16h后，添加EC各处理组的卵母细胞mtDNA拷贝数均有所增加，其中，10μmol/L组和15μmol/L组的mtDNA拷贝数均显著高于空白对照组（分别为618223±220584，777851±120487，对照组为304380±60963，P＜0.05）;但10μmol/L组mtDNA拷贝数更接近自然排卵周期卵子的mtDNA含量（618223±220584 vs587688±204035，P＞0.05）。体外成熟培养及孤雌激活的研究结果发现:成熟液中添加10μmol/L EC组的卵母细胞第一极体排出率与对照组相比差异不显著（P＞0.05），但能显著提高卵母细胞孤雌激活后胚胎的囊胚发育率（55.71％±2.84％ vs48.04％±3.54％,P＜0.05）。
　　其次，探索表儿茶素处理小鼠的用药方法。结果发现，腹腔注射EC组（495758±76910）和灌胃EC组（523196±89292）小鼠卵母细胞的mtDNA拷贝数差异不显著（P＞0.05）;而与各自的空载对照组相比mtDNA拷贝数均显著增加（495758±76910 vs281266±42266，523196±89292 vs275836±33959，P＞0.05）;注射EC组卵巢组织PGC-1α和Tfam基因的表达量与空载对照组相比均上调，且差异显著（P＜0.05）;注射EC2d组（489723±148982）和注射EC7d组（495758±203486）的mtDNA拷贝数差异不显著（P＞0.05），且均显著高于对照组（285786±99988，P＜0.05）;超排期间注射EC组与对照组相比，获卵数没有显著差异（22.80±5.84 vs21.35±5.12，P＞0.05）。
　　最后，探讨了超排期间注射表儿茶素对重复超排小鼠卵母细胞发育潜能的影响。结果发现，随着超排次数的增加，对照组获得的2-cell胚胎数显著减少，而EC处理组没有显著变化，并均与超排1次对照组获取的胚胎数差异不显著（20.25±1.06 vs19.25±1.95 vs20.33±1.61 vs21.00±0.71，P＞0.05）;胚胎进行体外培养后，发育到囊胚的比率和孵化囊胚率随着超排次数的增加呈现出逐渐下降的趋势，对照组的孵化囊胚率显著下降（超排1次为62.65±0.21;超排3次为53.52±3.13;超排5次为42.81±4.83，P＜0.05），但EC处理组孵化囊胚率和总囊胚率下降幅度相对较小;当超排次数增加至5次后，EC组和对照组的囊胚细胞凋亡率均显著增加（P＜0.05），对照组的细胞凋亡率显著大于EC组（3.74±0.86 vs3.10±0.74，P＜0.05）。荧光定量分析结果显示:超排1次时，EC处理组2-cell胚胎mtDNA拷贝数显著高于对照组（489723±148982 vs298333±139487，P＜0.05），然而连续超排3次和5次后，EC组与对照组的mtDNA拷贝数均大幅度增加，且各组间的差异不显著（769066±389862 vs811676±473759 vs743958±224432 vs771691±341214，P＞0.05）;与超排5次对照组相比，超排5次EC组小鼠卵巢组织GPX1、PRDX3、SOD和GLS2四种抗氧化酶基因表达均显著上调，卵巢GSH含量显著提高（46.68±2.67 vs37.74±3.80，P＜0.05）。
　　以上结果表明:（1）体外成熟液中添加适宜浓度（10μmol/L）的EC可提高小鼠卵母细胞的mtDNA拷贝数及其发育潜能;（2）通过灌胃和注射方法补充纯EC，均可以促进小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数增多;（3）小鼠超排期间注射一定剂量（10 mg/kg体重）的EC可使卵母细胞的mtDNA拷贝数增多，但不影响获卵数;（4）随着连续超排次数的增加，获得的胚胎数目减少、质量下降;然而，超排期间注射EC，能够明显改善上述异常。

目录

声明

摘要

综述

1 线粒体在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的作用

1．1 线粒体的结构以及在卵母细胞中的分布

1．2 mtDNA与卵母细胞发育潜能的关系

1．3 卵胞质ATP含量对卵母细胞和胚胎的影响

1．4 线粒体损伤与卵母细胞老化的关系

1．5 线粒体的钙稳态调节

2 线粒体的生物合成调节机制

3 重复排卵对雌性哺乳动物生殖功能的影响

3．1 重复排卵对卵母细胞数量和质量的影响

3．2 重复超排引起氧化应激

4 表儿茶素的生物学功能

4．1 抗氧化、抗辐射、抗炎、抗癌、抗衰老和抗凋亡等作用

4．2 促线粒体生物合成

4．3 表儿茶素的安全性

5 研究目的与意义

第一章 EC对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 方法

1．5 试验设计

1．6 统计方法

2 结果

2．1 卵母细胞mtDNA拷贝数

2．2 EC对小鼠卵母细胞极体排出率的影响

2．3 EC对小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎发育的影响

3 讨论

4 小结

第二章 表儿茶素处理小鼠方法的探索

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 方法

1．5 试验设计

1．6 统计方法

2 结果

2．1 注射法和灌胃法给药对小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数的影响

2．2 注射EC对小鼠卵巢PGC-1α、Tfam基因表达的影响

2．3 不同给药天数对小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数的影响

2．4 注射EC对小鼠超排获卵数的影响

3 讨论

4 小结

第三章 注射表儿茶索对多次超排小鼠卵母细胞发育潜能的影响

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 方法

1．5 试验设计

1．6 统计方法

2 结果

2．1 超排期间注射EC对多次超排小鼠获胚胎数的影响

2．2 超排期间注射EC对多次超排小鼠胚胎mtDNA拷贝数的影响

2．3 超排期间注射EC对多次超排小鼠胚胎发育的影响

2．4 超排期间注射EC对多次超排小鼠囊胚细胞凋亡的影响

2．5 超排期间注射Ec对多次超排小鼠卵巢抗氧化能力的影响

3 讨论

4 小结

总结论

参考文献

附录

图片与说明

致谢

攻读学位期间发表论文情况