基于拉曼光谱无损胚胎性别鉴定方法的研究

摘要

性别控制和鉴定技术作为社会发展中最有应用价值的成就之一，对人类和动物尤其是家畜的育种和生产有着深远的意义。精子流式分选和PCR扩增是目前用于性别控制和鉴定技术最为高效、主流和成熟的两种方法。但是这两种方法在实践应用中都存在一些无法避免的技术壁垒和不足，如精子分选速度满足不了需求、造成精子损伤等，以及PCR扩增需要样品的采集，特别是胚胎PCR活检容易引起胚胎污染，造成胚胎损伤，甚至死亡。探求一种无损的、非侵入性的、快速的胚胎性别鉴定方法，补充现有的性别控制和鉴定方法体系是必要的。本实验利用拉曼光谱技术通过对猪ICSI胚胎和牛IVF胚胎培养液进行分析，并利用PCR扩增鉴定其对应胚胎的性别，基于这些数据构建基于培养液拉曼光谱二值分类模型，为无损的、快速胚胎性别鉴定方法进行探索性研究。本研究主要内容如下。 1、机械损伤对猪孤雌胚胎发育代谢的影响 本研究选择猪ICSI胚胎培养液的代谢组学构建无损胚胎性别鉴定模型，为避免不同的显微操作对后续猪ICSI胚胎性别鉴定建模的干扰。首先利用显微操作仪制作了三个实验组包含不同机械损伤的孤雌胚胎，利用拉曼光谱技术分析了这三组胚胎培养液的代谢指纹。结果发现(1)第二组猪孤雌胚胎卵裂率、囊胚率最高，分别是98.34％，65.8％，其次是第一组，最低的是第三组，三组间差异显著(P＜0.05)。而囊胚总细胞数则是无损伤组（第一组）最多，但三者之无显著性差异(P＞0.05)。(2)在810、1003、1371、1563和1612cm-1拉曼位移处，特征峰强度明显减弱，特别是在1371cm-1位点;且拉曼强度的减弱程度与机械损伤程度有关，第三组的这几个拉曼位移特征峰的强度明显低于第二组的;第三组出现了1411cm-1特征峰;1437/1458拉曼强度比值随机械损伤减小、1586/1616的比值则因显微操作而增大。这些改变的拉曼位移主要归属膜脂和膜蛋白。(3)主成分分析发现，第三组的20个样品集中在一个区域，第一组20个样品分布最为广泛，第二组分布在第一组和第三组之间。(4)胚胎代谢液的拉曼光谱分析确定，无论是第二组还是第三组，其机械损伤对猪孤雌胚胎发育都造成了影响，只是损伤的程度有差别，而三组胚胎卵裂率和囊胚率比较，则得出显微破膜有助于卵母细胞激活和胚胎的发育。 2、猪ICSI囊胚PCR性别鉴定 为了构建胚胎代谢液拉曼光谱的性别鉴定模型，需要将胚胎的性别和拉曼光谱的数据一一对应，本试验借助巢式PCR技术扩增X、Y牙釉质基因(AMEL)第三内含子上9-10bp的缺失来鉴定猪单个胚胎性别。共计207个猪ICSI囊胚，30个孤雌胚胎，特异性扩增了199个ICSI样品和24个孤雌胚胎，8个ICSI胚胎扩增失败。经PCR产物片段扫描，只在178-179处有峰的，判定为雌性胚胎，在169-171和178-179两处有峰则判定为雄性胚胎。共确定雄性胚胎71个，雌性胚胎128个，其中公母比例1∶1.8。这很可能是超声波断尾造成精子基因组的损伤引起的。虽然卵母细胞有修复精子DNA损伤的能力，卵母细胞可以修复精子X染色体的基因损伤，而无法修复Y染色体上的基因损伤。 3、基于猪ICSI囊胚培养液拉曼光谱的无损性别鉴定 本试验通过采集199枚猪ICSI胚胎培养液的拉曼光谱，利用代谢组学分析方法初步建立了基于支持向量机的不同性别胚胎拉曼光谱分析模型，并进行了预测验证。结果确定猪ICSI雄性胚胎培养液在1082和1360cm-1拉曼位移处特征峰强度明显高于猪ICSI雌性胚胎的。构建的胚胎性别鉴定模型的分类准确率92％，雌性灵敏度89.7％，雄性灵敏度96％。分类预测验证的成功率为81.48％，3个雌性胚胎被预测为雄性，2个雄性被预测为雌性。 4、基于牛IVF囊胚培养液拉曼光谱的无损性别鉴定 利用同样的方法对108枚牛IVF不同性别胚胎培养液平均拉曼光谱进行分析，构建牛IVF胚胎培养液拉曼光谱无损性别鉴定模型。发现雌性胚胎培养液在650和810cm-1特征峰的强度高于雄性胚胎。650cm-1特征峰归属酪氨酸C-C摇摆振动，810cm-1归属磷酸二酯键O-P-O对称伸缩振动。牛IVF胚胎培养液性别鉴定模型的分类准确率为75％，雌性敏感度60％，雄性敏感度90％。22个未知样品用于模型预测验证，6个预测错误，其中，4个雌性被预测为雄性，2个雄性被预测为雌性，预测的准确率为72.72％，低于猪胚胎预测的准确率。 结论:基于本试验的研究结果，认为基于胚胎代谢液的拉曼光谱性别鉴定方法是非常可行的，虽然预测准确率目前仅有81％，但拉曼光谱技术的快速、非损伤、易操作、成本低，样品无需前处理等优势，有必要增加样本数和进一步优化建模算法，提高性别预测的准确性。

目录

声明

摘要

第一章综述

1、无损胚胎性别鉴定技术的研究意义

2、性别控制和鉴定技术的研究现状

2．1动物性别鉴定和控制技术的研究进展

2．2性别控制和鉴定技术的方法

3、拉曼光谱技术在生命科学领域的应用研究

3．1拉曼光谱技术的简介

3．2拉曼散射的原理

3．3拉曼光谱仪介绍

3．4拉曼光谱技术的应用

4、基于拉曼光谱技术无损的胚胎性别鉴定

4．1光谱技术用于性别鉴定

4．2光谱技术在胚胎培养代谢液分析中的应用

4．3胚胎早期发育

4．4雌、雄早期胚胎增殖分化差异

第二章机械损伤对猪孤雌胚胎发育的影响

前言

1、材料和方法

1．1实验材料

1．2主要试剂药品和溶液配制

1．3主要仪器设备

2、实验方法

2．1猪卵母细胞的收集和成熟培养

2．2卵丘细胞的分离和挑选

2．3显微操作

2．6单胚胎培养和代谢液的收集

2．7囊胚总细胞数的统计

2．8单胚胎培养液拉曼光谱的采集

2．9拉曼原始数据的处理和多元分析

2．10胚胎发育实验数据的统计和分析

3、试验结果

3．1三种处理对猪孤雌胚胎发育的影响

3．2囊胚及其代谢液的收集

3．3胚胎培养液的拉曼测定

4、讨论

4．1显微注射对细胞造成的机械损伤

4．2三组猪孤雌胚胎培养液拉曼光谱分析

4．3多元统计分析—主成分分析

4．4拉曼分析结果与胚胎发育统计结果之间的分析

5、小结

第三章猪囊胚巢式PCR性别鉴定

前言

1、材料和方法

1．1主要药品和溶液配制

1．2主要实验仪器

1．3引物设计和合成

1．4实验方法

2、结果

2．1基因组扩增

2．2猪囊胚巢式PCR扩增

2．3巢式PCR片段的扫描

2．4雄性胚胎PCR产物的直接测序

3、讨论

4、小结

第四章基于猪ICSI囊胚培养液拉曼光谱的无损性别鉴定方法的研究

前言

1．1实验材料

1．2主要试剂药品和溶液配制

1．3主要仪器设备

2、实验方法

2．1猪卵母细胞的收集和成熟培养

2．2卵丘细胞的分离和挑选

2．3精子的清洗

2．4胞质内精子显微注射

2．5 ICSI胚胎的化学激活和培养

2．6单胚胎培养和代谢液的收集

2．7单胚胎培养液拉曼光谱的收集

2．8原始数据的处理和多元分析

3、结果

3．1胚胎代谢液和囊胚的收集

3．2胚胎代谢液拉曼光谱的采集和分析

3．3样品的分组

3．4拉曼数据的SVM分类预测

3．5测试集的预测结果

4、讨论

5、小结

第五章：基于牛IVF囊胚培养液拉曼光谱的无损性别鉴定方法的研究

1．2主要试剂药品和溶液配制

1．3主要仪器设备

2、实验方法

2．1发情牛血清的制备

2．2牛卵泡液的制备

2．3单层的制备

2．4卵巢的准备

2．5卵母细胞收集

2．6卵母细胞体外成熟(IVM)

2．7牛卵母细胞的体外受精

2．8胚胎体外培养

2．9单胚胎培养液的收集

2．10单胚胎培养液拉曼光谱的收集

2．11牛囊胚巢式PCR性别鉴定

2．12原始数据的处理和多元分析

3、结果

3．1胚胎代谢液和囊胚的收集

3．2黄牛囊胚PCR性别鉴定

3．3胚胎代谢液拉曼光谱的采集和分析

3．4样品的分组

3．5拉曼数据的SVM分类和测试集的预测结果

4、讨论

5、小结

总结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表文章情况

获奖情况