以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法

摘要

本发明涉及一种以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法，包括精子分离和冷冻保存，生产性别控制胚胎和胚胎性别鉴定步骤，其中精子分离和冷冻保存包括采集新鲜精液、分离前的精子处理、精子分离处理、冷冻保存；生产性别控制胚胎和胚胎性别鉴定步骤包括胚胎生产(体内或试管技术)、胚胎切割、PCR法鉴定胚胎性别。本发明具有以下优点：分离精子的准确率达90％以上，精子活力保持在50％以上，胚胎的性别鉴定准确率约为100％。

说明书

技术领域

本发明属于一种家畜性别控制方法，特别涉及一种以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法。

背景技术

哺乳动物(含家畜)的性别由受精时精液中的X和Y精子来决定。X精子和卵子结合产生母性个体，Y精子则导致雄性个体的发生。在正常家畜精液中由于X精子和Y精子的比例相当，因此产生后代中的雌雄约各占50％。对于实际产业经营来说，如果能够把X精子和Y精子分开，就可以根据生产需要选择家畜的性别，比如肉牛繁殖者要求尽可能提高雄性牛犊的出生率，而奶牛经营者则认为多生母牛犊可以获取更大的经济效益。

自从上世纪六十年代人工授精技术的普及应用，以及七十年代开始的胚胎移植技术的尝试，众多研究人员开始进行精子分离和胚胎性别鉴定的研究探讨。精子分离的基础是利用X精子和Y精子之间的理化、生理、遗传基因等方面的差异，比如重量、表面电荷、PH值以及抗原性等来设计各种实验模型，其中包括沉淀法、密度梯度离心法、电泳法、抗原抗体法等。但是上述诸方法由于分离精子的准确率差或者完全没有效果，对精子活力的损害等原因，到上世纪九十年代基本上被大多数研究人员的实验结果所否定，因此也就无法作为一项实用技术应用到生产实践。另外，胚胎的性别鉴定也是类似情况。

发明内容

本发明的目的是提供一种以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法，它克服了上述的缺陷，以X精子和Y精子DNA含量的微小差别为基础的流式细胞分离法的准确率为90％，以人工授精为主的精子活力为50％，达到了产业应用水平；以Y精子特异性DNA片断为主的胚胎性别鉴定技术准确率接近100％。

本发明以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法，包括以下步骤：

(1)精子分离和冷冻保存

A、从家畜体中采取新鲜精液1毫升，用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP，离心洗涤2次，2000转，5分钟，然后用所述的磷酸缓冲液把精子浓度调至100×10⁶个/毫升，每毫升新鲜精液可调制10-15毫升上述浓度的稀释精液。

B、在精液中添加10微克/毫升荧光染色剂，在37℃的条件下DNA染色30分钟，然后用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP，离心洗涤2次，2000转，5分钟；

C、重新把精子浓度调至100×10⁶个/毫升，然后装入流式细胞分离机内，以每秒钟3000个精子的速度进行分离，分开后的X精子和Y精子被回收后，按照每支250～500万个精子的总数，装入0.25毫升精液冷冻管，按照常规方法制成冷冻精液，保存于液化氮内，1毫升新鲜精液可以生产上述分离后的X精子或Y精子的冷冻精液各10-15支；

D、生产性别控制胚胎：把分离后的精子以每支200个卵子的比例进行体外授精和培养，可以生产25-30个经过性别控制的A-B等级胚胎(囊胚)，用于胚胎移植；

(2)、胚胎性别鉴定：

A、以使用冷冻胚胎为主；

B、胚胎细胞切割：取解冻后的囊胚，在所述的磷酸缓冲液加0.25％的蛋白酶中处理2-3分钟，使胚胎的透明带软化，然后移入所述的磷酸缓冲液加0.3％的血清蛋白溶液中，每次处理胚胎数20-40个左右；

C、在显微镜下，用刀端呈15°角，胚胎切割专用的金属刀片，或玻璃细针切下胚胎的营养层细胞10-15个，把切下的细胞和胚胎的主要部分，包括内胚团细胞，分别对应编号，胚胎的主要部分放入胚胎保存液TCM199-10％FBS中，在CO₂培养箱中保留2-4小时；

D、以一种DNA体外合成技术PCR法对切下的细胞进行雌、雄性别鉴定，切取的每个胚胎细胞样品移入10微升纯水的PCR反应管中，水中快速清洗3次，以100℃的水浴处理10分钟，然后取1微升进行PCR反应，以BOV97M(157bp，一种雄性牛的Y染色体的特异性基因断片)为雄性探针，以a-乳清蛋白基因片段(109bp)为雌性样品探针；

PCR反应液的组成：200微摩尔的脱氧核苷酸、各40微摩尔的雄性和雌性样品探针模板、1.25国际单位的DNA聚合酶(1.25Iu Taq聚合酶)、PCR缓冲液，用纯水将总液量调至50微升；

PCR反应的条件：95℃ 1分钟、55℃ 2分钟、72℃ 3分钟，上述条件重复40次；

PCR反应样品检查：取反应后的每个样品，以3％的琼脂糖电泳20分钟，具有157bp，109bp双带的胚胎为雄性，只有109bp带的胚胎为雌性，没有带的为样品操作失误或丢失。

根据PCR的检查结果，就可以确定对应胚胎的性别，然后根据需要把胚胎进行移植或冷冻保存。此技术过程约需2-3小时，样品的处理可以重叠进行，胚胎的性别鉴定准确率约为100％。

所说的荧光染色剂为Hoechst 33342。

本发明具有以下优点：分离精子的准确率达90％以上，精子活力保持在50％以上，胚胎的性别鉴定准确率约为100％。

附图说明：

附图1是本发明工艺方法流程图。

附图2是胚胎切割模型图和胚胎实际切割图。

附图3是本发明染色体检查确认PCR结果图。

具体实施方式：

如图所示：一种以精子分离、胚胎性别鉴定为基础的家畜性别控制方法，包括以下步骤：

(1)精子分离和冷冻保存：

A、从正常种公牛采取新鲜精液1毫升，用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP，离心洗涤2次，2000转，5分钟，然后用所述的磷酸缓冲液把精子浓度调至100×10⁶个/毫升，每毫升新鲜精液可调制10-15毫升上述浓度的稀释精液；

B、在精子液中添加10微克/毫升荧光染色剂Hoechst 33342，在37℃的条件下DNA染色30分钟，然后用磷酸缓冲液PBS-0.05％PVP离心洗涤2次，2000转，5分钟；

C、重新把精子浓度调至100×10⁶个/毫升，然后装入流式细胞分离机内，以每秒钟3000个精子的速度进行分离，分开后的X精子带正电和Y精子带负电分别被回收后，按照每支250～500万个精子的总数，装入0.25毫升精液冷冻管，按照常规方法制成冷冻精液，保存于液化氮内，1毫升新鲜精液可以生产上述分离后的X精子或Y精子的冷冻精液各10-15支；

D、生产性别控制胚胎：由于胚胎的性别由受精时的精子型决定，因此利用分离后的X精子或Y精子直接生产试管胚胎，扩大分离精子的使用效率，具体方法是把分离后的精子以每支200个卵子的比例进行体外受精和培养，可以生产25-30个经过性别控制的A-B等级胚胎(囊胚)，冷冻保存，用于胚胎移植；

(2)、胚胎性别鉴定：

A、胚胎性别鉴定以使用冷冻胚胎为主；

B、胚胎细胞切割：取解冻后的囊胚在所述的磷酸缓冲液加0.25％的蛋自酶中处理2-3分钟，使胚胎的透明带软化，然后移入所述的磷酸缓冲液加0.3％的血清蛋白溶液中，每次处理胚胎数20-40个左右；

C、  在显微镜下，用刀端呈15°角，胚胎切割专用的金属刀片切下胚胎的营养层细胞10-15个，把切下的细胞和胚胎的主要部分，包括内胚团细胞，分别对应编号，胚胎的主要部分放入胚胎保存液TCM199-10％FBS中，在CO₂培养箱中保留2-4小时；

D、  以一种DNA体外合成技术PCR法对切下的细胞进行雌、雄性别鉴定，切取的每个胚胎细胞样品移入10微升纯水的PCR反应管中，水中快速清洗3次，以100℃的水浴处理10分钟，然后取1微升进行PCR反应；以BOV97M(157bp，一种雄性牛的Y染色体的特异性基因断片)为雄性探针，以a-乳清蛋白基因片段(109bp)为雌性样品探针；

PCR反应液的组成：200微摩尔的脱氧核苷酸、各40微摩尔的雄性和雌性样品探针模板、1.25国际单位的DNA聚合酶、PCR缓冲液，用纯水将总液量调至50微升；

PCR反应的条件：95℃ 1分钟、55℃ 2分钟、72℃ 3分钟，上述条件重复40次；

PCR反应样品检查：取反应后的每个样品，以3％的琼脂糖电泳20分钟，具有157bp，109bp双带的胚胎为雄性，只有109bp带的胚胎为雌性，没有带的为样品操作失误或丢失。

根据PCR的检查结果，就可以确定对应胚胎的性别，然后根据需要把胚胎进行移植或冷冻保存。此技术过程约需2-3小时，样品的处理可以重叠进行，胚胎的性别鉴定准确率约为100％。

检测结果：

本技术在实验室和产业中试水平上均进行了具体实施，并对其结果进行了不同层次的检测，具体方法和结果如下：(参见图3)

1、分离精子的准确率和受精性：

(1)分离精子的准确率检查(原位分子杂交法)

检查精子总数：2000个

X精子样品(强荧光)      X精子93.6％      Y精子6.4％

Y精子样品(弱荧光)      Y精子81.8％      X精子18.2％

(2)利用分离精子受精后的产犊检查(显微受精胚胎)

Y精子样品10头        雄性8头/雌性2头     准确率80.0％

(3)性别控制胚胎的生产和鉴定(PCR法检查)

Y精子样品：体外受精处理卵子187个，得到A-B囊胚62个

           (26.3％)，其中雄性胚胎占86％

X精子样品：体外受精处理卵子235个，得到A-B囊胚79个

           (36.6％)，其中雌性胚胎占91％

2、性别鉴定胚胎的准确率检查：

检查胚胎数46个，其中雄性胚24个(52.1％)，这些胚胎移植后产犊总数15头(受胎率62.5％)：雄性15头(100％)，雌性0头(0％)。