HSP70基因与马内菲青霉致病性相关分析

摘要

一、研究背景：马内菲青霉病是一种由马内菲青霉所引起的严重的深部真菌病，主要流行于东南亚地区，如泰国、越南、柬埔寨、老挝、香港和我国南方等地。该菌于1956年由Capponi等从被感染竹鼠分离到。在艾滋病流行以前，该病仍较为罕见，但近年来随着艾滋病在亚洲的流行，马内菲青霉病的发病率也迅速升高。现已成为泰国艾滋病患者中继肺结核(31.3％)、隐球菌病脑膜炎(24.1％)之后第三大条件致病菌感染。广东省近年来发病的报道也逐渐增多，自从1988年广东省首次从一例皮肌炎患者胸水中分离出马内菲青霉后，发现的病例已有30余例，其中50％与AIDS有关，广东已成为继中国广西之后马内菲青霉病发病的重要流行区。 马内菲青霉菌既可以感染正常人体，也可以感染免疫力缺陷的病人。值得注意的是，它是HIV携带者主要的条件致病菌之一。其它易感因素包括结核、自身免疫性疾病和接受糖皮质激素治疗。在整个青霉属中，马内菲青霉与众不同，是唯一的双相性真菌。在组织中或37℃体外培养时呈酵母样生长，而26℃时以霉菌样生长。体外培养时，26和37℃之间改变温度可以触发两相的互相转化。菌丝到酵母相的转化过程特别引人注目，这一过程在真菌的致病性中可能起着重要作用。 热休克蛋白(heatshockproteins)是细胞在热、寒冷、缺氧等环境压力作用下所产生的一组蛋白质。它们存在于任何生物的细胞中，可保护细胞不受或少受环境压力的伤害作用。目前已经发现多种HSP，根据蛋白序列同源性和分子量大小，主要分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及小HSP五个家族，而其中HSP70是最保守、最丰富、也是研究最深入的一种。各种生物的HSP70及其编码基因均具有进化上的高度保守性，不同来源的真核生物其HSP70的同源性为60％～78％。 除了热休克反应，热休克蛋白也是细胞正常功能所必需的一种蛋白，而且参与多种疾病的发生，例如癌症、心脏病、糖尿病和自身免疫性疾病。其作用机制主要是起“分子伴侣”作用。能介导细胞内多种蛋白的折叠过程，包括新合成蛋白质的折叠和装配、错折叠和凝集蛋白的二次折叠、细胞器间的膜转位、外分泌和控制调节蛋白的活性。 多种病原体包括细菌、寄生虫等感染宿主后，对新的生存环境进行适应，会出现形态分化并可能伴有热休克蛋白的产生。马内菲青霉从外界进入人体后，环境温度升高，引发形态转化，可能会导致热休克反应。从而提高真菌对环境压力的抵抗力，确保其在体内的存活，增强其致病性。因此，有必要探索其在两相转化下的hsp70基因表达情况。 二、研究目的：初步探讨马内菲青霉双相转化中hsp70基因转录、蛋白表达变化情况。 三、材料与方法：1.菌株：我院真菌研究中心保存的0152株。 2.真菌培养：保存菌种用Sabouraud固体培养基25℃斜面培养，每30天接种传代一次。用于双相转化研究时，菌丝相在25℃Sabouraud液体培养基振荡培养72h后收集；37℃脑心浸液固体培养基培养诱导酵母相出现后再转种37℃脑心浸液液体培养基振荡培养72h后收集。 3.逆转录PCR：使用Trizol试剂提取总RNA。利用设计好的hsp70引物，以总cDNA为模板，进行RT-PCR扩增。同时扩增内参照β-actin基因(一种管家基因，在多种细胞中稳定的高表达)。通过电泳，使用凝胶成像软件分析两个条带的密度，以密度比值衡量hsp70基因转录水平，在不同形态的菌间进行半定量比较。 4.蛋白印迹：以鼠抗HSP70IgG抗体作为一抗，鼠抗β-actin抗体为内参蛋白一抗，以辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体作为二抗。提取总蛋白后，做SDS-PAGE-维电泳，然后转移至醋酸纤维素膜上，分别加入一抗、二抗和显色剂。使用软件分析两个条带的密度，以HSP70条带与内参条带密度比值衡量hsp70基因表达水平，在不同形态的菌间进行半定量比较。 四、实验结果：马内菲青霉酵母相的hsp70基因的转录较菌丝相升高；马内菲青霉酵母相的HSP70蛋白的表达较菌丝相升高。 五、结论：马内菲青霉hsp70基因在两相间存在明显表达差异，其基因转录和表达水平在酵母相均表现为一致的上调，这提示hsp70基因与致病性密切相关。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章研究目的

第3章材料与方法

第4章实验结果

第5章讨论

第6章结论

参考文献

英文缩略词表

附图

致谢