马内菲青霉蛋白的分离及其与致病性关系的初步探讨

摘要

一、研究背景马内菲青霉(Penicilliummarneffei，PM)属真菌界，半知菌亚门，丝孢菌纲，丝孢目，青霉属，双轮青霉亚属。PM感染人体引起马内菲青霉病(Penicilliosismarneffei，PSM)，主要累及单核——巨噬细胞系统，常引起全身广泛播散，病死率高。该菌的感染有一定的地域性，主要分布在东南亚地区，如泰国、越南、柬埔寨、老挝、香港和我国南方的广西省等地。近年来随着艾滋病发病率的升高，PSM的发生呈上升趋势，成为曾经居住过或访问过东南亚的AIDS患者最常见的机会性感染之一。既往中国的PSM主要发生于广西壮族自治区，多散发，且与艾滋病有关的感染较少见。自1988年广东省首次从一例皮肌炎患者胸水中分离出PM后，报道病例不断增多，广东省已成为继广西后的PSM的另一重要流行区，且大部分的已发病例与艾滋病相关。 PM是青霉属300多种青霉中唯一的双相型真菌，25℃室温中培养时为分隔菌丝相，以无性孢子繁殖；37℃培养时呈酵母相，以分裂繁殖。在自然环境中以菌丝相存在，竹鼠普遍带菌而不发病成为自然宿主。人体感染PM后部分个体可发病，尤其见于艾滋病患者及其他免疫抑制状态患者，PM在体内呈酵母细胞生长。病理切片巨噬细胞内可发现酵母细胞，病情进展期PM也出现在细胞外，呈伸长、腊肠样细胞，可具有一至两个横隔，但与长形、多分隔的菌丝明显不同，仍是属于酵母细胞。体外37℃培养所见酵母大小形态与病理组织中形态特征基本相同。 我们对PM的感染途径、感染机制以及与宿主的相互免疫反应所知甚少。目前认为孢子经呼吸道进入宿主，并被肺泡巨噬细胞吞噬是最为可能的入侵途径。对其它双相真菌，如皮炎芽生菌、组织胞浆菌、巴西副球孢子菌的相关研究表明，从菌丝相到酵母相的双相性转换过程是病原体起致病作用所必需的。PM在体内也存在双相性转换过程，对某些基因的研究发现其对调控形态转换起一定作用，但未能发现与致病性的直接联系。体外实验证实巨噬细胞在受相应细胞因子的活化后，对PM具有杀伤作用，据此推测在体内同样发挥抗真菌作用。但研究表明PM在宿主体内被巨噬细胞吞噬，未被清除而成为细胞内病原体，在细胞内繁殖，引起细胞破裂而使感染播散。 由此PM致病性的探讨集中至以下问题：1.马内菲青霉在宿主体内出现形态转换的意义何在，是否提示形态转换在致病中起必不可少的关键作用?2.马内菲青霉不被巨噬细胞清除的机制何在，是否提示在巨噬细胞内存活是致病的前提条件?3.为什么此现象绝大多数发生在免疫缺陷患者，马内菲青霉致病性与宿主免疫状态间相互关系如何?明确以上问题，对我们理解马内菲青霉的致病性以及如何在免疫缺陷患者中形成播散感染有重要意义；明确该病的发病机制，也可以为防治艾滋病及其他免疫抑制状态患者的机会性感染提供新的抗真菌药物靶。 研究目的分离PM菌丝相与酵母相的蛋白质，比较两相之间的差异表达蛋白，筛选出致病相关蛋白，初步探讨其与PM致病性的关系。 材料与方法1.实验菌株：分离自我科PSM病人的PM临床株SUMS0152。 2.双相性诱导与菌株的培养：以温度作为处理因素，体外进行双相性诱导，25℃培养菌丝相，37℃诱导酵母相的转变。 3.实验分组：菌丝组，4个样品H1、H2、H3、H4，每个样品均在相同菌丝培养条件下获得，保证形态学一致；酵母组，4个样品Y1、Y2、Y3、Y4，每个样品均在相同酵母培养条件下获得，保证形态学一致。8个样品跑4张分析胶，两张制备胶。 4.样品制备：使用玻璃珠机械破壁，变性剂、蛋白酶抑制剂、超声破碎等方法结合，提取菌丝相、酵母相菌体全蛋白。 5.样品荧光标记：采用最小标记法，CyDye荧光染料与蛋白样品比例为400pmol：50μg。 6.DIGE双向电泳及图像分析：第一向等电聚焦使用24cmpH3-10非线性的IPG胶条，上样体积为450μl。分析胶450μl水化液中含蛋白样品150μg，制备胶450μl水化液中含蛋白样品500μg。第二向SDS-PAGE在DALT-six系统中进行，分离胶浓度为12.5％。制备胶深紫色全蛋白荧光染色。凝胶图像扫描及图像分析。 7.蛋白点统计、分析：使用随机化配对t检验，以菌丝相为对照组(contr01)，包括H1、H2、H3和H4，酵母相为处理组(treated)，包括Y1、Y2、Y3和Y4，计算蛋白点表达丰度变化的P值以及Averageratio值。 8.蛋白点筛选：使用蛋白过滤功能(proteinfilter),根据计算出来的Averageratio值和t检验的P值等筛选条件来筛选出兴趣蛋白(proteinsofinterest，POI)。 9.全自动斑点工作站对兴趣蛋白进行切点、点样。MALDI-TOF-MS鉴定蛋白质。生物信息学对相关蛋白质进行初步筛选。 结果1.双相性诱导：体外改变温度可以成功诱导PM双相性转变； 2.成功提取菌体全蛋白，获得满意蛋白浓度； 3.标记测试显示PM蛋白可以与CyDye荧光染料共价结合； 4.蛋白分离：分析胶、制备胶上均能分离出3000～4000个蛋白斑点，各胶之间的重复性好，分析胶匹配率达74％以上； 5.蛋白比较及鉴别：专业分析软件比较两相的蛋白表达谱，得出具有统计学意义的差异蛋白达511个，经MALD-TOF-MS鉴定出差异蛋白26个； 6.根据生物信息学对26个差异蛋白进行初步筛选，认为过氧化氢酶—过氧化物酶、ICL、热休克蛋白家族可能为致病相关蛋白； 7.过氧化氢酶家族在PM中表达丰富，35个蛋白斑点被鉴定过氧化氢酶。这35个蛋白点表达变化趋势一致，在酵母相的表达明显增加。其中Spotno.1297为过氧化氢酶—过氧化物酶，氨基酸序列已知，在酵母相中的表达是菌丝相的14.38倍 8.凝胶上3个蛋白斑点被鉴定为ICL，分别是Spotno.1089、1091、1092，这三个斑点都显示在酵母相表达增加。其中Spotno.1091在酵母相中的表达是菌丝相的5.32倍。 9.鉴定出的热休克蛋白家族蛋白包括有热休克蛋白90(Spotno.613)、HSP90同体(Spotno.76D、BiP(Spotno.698)以及热休克相关蛋白70(Spotno.79D。这四个蛋白酵母相与菌丝相表达量比较分别是5.29、6.93、4.91和3.66，均出现一个相同的表达趋势：在酵母相的表达量较菌丝相明显升高。 结论1.首次建立了PM菌体全蛋白的胶内差异双向电泳分离方法，筛选出一批在酵母相与菌丝相间存在差异表达的蛋白。 2.初步认为过氧化氢酶—过氧化物酶、异柠檬酸裂解酶、热休克蛋白家族与PM致病性密切相关。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章研究目的

第3章材料与方法

第4章实验结果

第5章讨论

第6章结论

参考文献

附录

附图

致谢