家蝇抗菌肽cecropin基因在原核细胞中的高效融合表达及抑制性消减文库的构建

摘要

家蝇天蚕素(Mdmcec)分子量约为4.0 kDa，由31～39个氨基酸残基组成，对革兰氏阴性菌和阳性菌具有较强的抑制作用，对病毒、真菌也有一定的抑制作用，有望发展为新一代肽类抗生素。本论文以家蝇为实验材料，以Mdmcec为基础，对其抗血清的制备、体外高效表达进行了较详尽的研究，并对家蝇体内的免疫和发育相关因子进行了差异筛选。 为增强Mdmcec的抗原性，利用同尾酶技术构建了Mdmcec六拷贝首尾串联的融合表达载体pQEMdmcec6，并在大肠杆菌M15中得到高效表达，包涵体蛋白经尿素变性后，利用镍螯和层析纯化了串联体蛋白，纯化量为30mg/l。将纯化蛋白免疫新西兰大白兔，成功制备了Mdmcec6串联体抗血清(命名为： anti-Mdmcec6)。ELISA实验结果表明抗6His-Mdmcec6的滴度高达1∶12400，抗Mdmcec的效价为1∶5000。Western blot分析表明，制备的抗血清不仅能特异性地识别纯化的Mdmcec，而且能特异性地识别家蝇蛋白粗提液中的cecropin。 为了高效表达可溶性的Mdmcec，本研究利用基因工程手段，构建了家蝇抗菌肽cecropin基因与硫氧还蛋白(Trx)融合的表达质粒pTRX-Mdmcec，在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、可溶性表达。融合蛋白经镍螯和层析一步纯化，纯化的融合蛋白经肠激酶切割后，释放出具有杀菌活性的Mdmcec。重组Mdmcec经镍螯和层析和RP-HPLC得到纯化，纯化量为111.2 mg/l。Western blot检测表明，Mdmcec能被anti-Mdmcec6抗体特异性地识别。电喷物质谱(ESI-MS)分析表明，Mdmcec的分子量为4.0 kDa。圆二色谱(CD)分析其二级结构中不含β-sheet结构，由61﹪a-helix和39﹪的Random组成。液相法测定Mdmcec抑菌活性表明，Mdmcec不仅对革兰氏阴性菌E. coli K<,12>D<,31>和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus有很强的抑菌活性，而且对一些真菌也有很强的抑制作用，且对鼠血细胞无溶血作用。杂合肽CA-MA(家蝇cecropinA(1-8)和非洲爪蟾magainin2(1-12))具有广谱的抗菌活性。为了廉价生产家蝇抗菌肽cecropin和CA-MA，本实验将Mdmcec和CA-MA与家蝇泛素(ubiquitin)融合，构建了能表达天然N末端蛋白的原核表达质粒pQEUBIMdmcec和pQEUBICAMA，并在宿主菌M15中得到高效表达，表达量分别为47 mg/l和36 mg/l的融合蛋白。 为了给泛素融合蛋白的切割提供高活性的泛素C末端水解酶，并便于纯化切割后释放出的抗菌肽。本实验将果蝇泛素水解酶(FUCH)插入到毕赤酵母载体pPICZaA，在酵母细胞GS115中高效表达了C端带有6His纯化标签的FUCH，FUCH经镍螯和层析得到简易纯化，纯化量为19 mg/l。 Tricine-SDS-PAGE和活性测定表明，融合蛋白经FUCH切割后，释放出具有杀菌活性的抗菌肽Mdmcec和CA-MA，且分子量与预期大小一致。Mdmcec和CA-MA经镍螯和层析、超滤和RP-HPLC得到进一步的纯化后，获得重组蛋白分别为8.4 mg/l和6.8 mg/l。激光飞行质谱(MADU-TOF-MS)分析表明，MdmceC和CA-MA分子量分别为4032 Da和2559Da。圆二色谱(CD)分析CA-MA二级结构表明，CA-MA在水相中的二级结构不含β-sheet结构，由17.4﹪a-helix和82.6﹪的Random组成。活性测定表明重组蛋白对革兰氏阴性菌、阳性菌和真菌有很强的抑制作用，而且对小鼠血细胞无溶血作用。 为了寻找家蝇免疫调控相关因子和发育调控基因，本研究以健康家蝇三龄幼虫为对照群体，以细菌诱导后的三龄幼虫和蛹为目标群体，构建了抑制性差减文库(SSH)。对PCR筛选的部分克隆子测序，获得了359条ESTs。将ESTs进行同源性分析，获得了143条不同ESTs，可初步分为六类，第一类：13条免疫相关ESTs；第二类：18个转录因子相关ESTs；第三类：61条酶类相关的ESTs：第四类：25条受体相关ESTs；第五类：14条ESTs，其中包括发育相关、细胞调亡相关、细胞骨架和功能未知的ESTs；第六类：家蝇已经在GenBank登录的12条ESTs。总之，本论文首次成功制备了Mdmcec抗血清，为抗菌肽抗血清的制备提供了新的思路，并为抗菌肽cecropin在蛋白水平上的检测提供了分子依据；抗菌肽的体外成功的高效融合表达为抗菌肽的功能与结构研究及其应用提供了经济的表达平台；家蝇SSH文库的构建为更好地研究免疫和发育相关因子提供了分子平台。

目录

文摘

英文文摘

前言

第1章绪论

前言

1.1抗菌肽的分类

1.2抗菌肽的结构和性质

1.3抗菌肽的活性

1.4抗菌肽的作用机制

1.5抗菌肽的应用

1.6抗菌肽的表达策略

1.7抗菌肽抗体制备的研究进展

1.8抗菌肽应用中亟待解决的问题

1.9家蝇抗菌肽的研究现状

第2章家蝇抗菌肽cecropin六串联体的高效表达及其多克隆抗体的制备

前言

2.1材料

2.2方法

2.2.1家蝇饲养

2.2.2家蝇三龄幼虫的诱导

2.2.3家蝇cecropin成熟肽(Mdmcec)基因的克隆

2.2.4 Mdmcec不同串联体的构建

2.2.5各串联体的原核诱导表达

2.2.6六串联体蛋白的纯化

2.2.7抗血清的制备与检测

2.2.8 SDS-PAGE电泳及Western印迹分析

2.3结果与分析

2.3.1家蝇三龄幼虫总RNA的提取

2.3.2 Mdmcec的RT-PCR扩增及其酶切鉴定

2.3.3 Mdmcec串联体的构建

2.3.4各串联体的测序鉴定

2.3.5六串联体的原核表达

2.3.6目的蛋白的纯化

2.3.7多克隆抗血清的制备与检测

2.3.8家蝇不同组织中cecropin的检测

2.4讨论

2.4.1抗菌肽抗体的制备

2.4.2串联体的构建

2.5小结

第3章Mdmcec与硫氧还蛋白在原核细胞中的高效融合表达

前言

3.1材料

3.2方法

3.2.1家蝇cecropin基因成熟肽的克隆

3.2.2 Mdmcec重组表达载体的构建

3.2.3 工程菌株的筛选

3.2.4外源蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化

3.2.5融合蛋白的可溶性分析

3.2.6融合蛋白的纯化与检测

3.2.7重组蛋白的释放与纯化

3.2.8重组Mdmcec的HPLC分析

3.2.9重组蛋白的Tricine-SDS-PAGE及Western印迹分析

3.2.10重组Mdmcec的圆二色谱测定

3.2.11重组蛋白的杀菌活性检测

3.2.12重组蛋白的杀菌谱测定

3.2.13溶血性测定

3.3结果与分析

3.3.1家蝇Mdmcec基因的PCR结果

3.3.2重组表达质粒的构建

3.3.3融合蛋白的诱导表达

3.3.4融合蛋白的纯化

3.3.5融合蛋白的酶切及重组蛋白的纯化

3.3.6 Mdmcec的质谱分析

3.3.7重组Mdmcec的圆二色谱分析

3.3.8初步抗菌活性分析

3.3.9重组蛋白的抗菌谱测定

3.3.10家蝇Mdmcec的溶血性分析

3.4讨论

3.4.1抗菌肽在原核细胞中的融合表达

3.4.2重组蛋白释放与活性检测

3.4.3重组蛋白在荔枝保鲜上的应用

3.5小结

第4章泛素融合技术在原核细胞高效表达抗菌肽中的应用

前言

4.1材料

4.2方法

4.2.1重组质粒pQEUBI的构建

4.2.2 Mdmcec和CA-MA序列的获得

4.2.3抗菌肽融合表达表达质粒的构建

4.2.4目的蛋白的诱导表达

4.2.5融合蛋白的可溶性分析

4.2.6融合蛋白的纯化

4.2.7果蝇泛素水解酶在毕赤酵母中的表达

4.2.8融合蛋白的酶切

4.2.9重组蛋白Mdmcec和CA-MA的纯化

4.2.10重组蛋白的分子量测定

4.2.11重组蛋白的圆二色谱测定

4.2.12重组蛋白的抑菌活性检测

4.2.13重组蛋白的杀菌谱测定

4.2.14溶血性测定

4.3结果与分析

4.3.1原核表达质粒pQEUBI的构建

4.3.2泛素融合表达载体的构建

4.3.3诱导表达产物的SDS-PAGE分析和免疫印迹分析

4.3.4表达产物的可溶性分析

4.3.5融合蛋白的纯化

4.3.6果蝇泛素水解酶在毕赤酵母中的表达

4.3.7融合蛋白的酶切

4.3.8重组蛋白的纯化

4.3.9重组蛋白MALDI-TOF-MS检测

4.3.10重组CA-MA的圆二色谱分析

4.3.11重组蛋白的生物活性检测

4.3.12重组蛋白的杀菌谱测定

4.3.13杂合肽CA-MA的溶血性分析

4.4 讨论

4.4.1抗菌肽的融合表达

4.4.2泛素特异性蛋白酶的应用

4.5 小结

第5章家蝇抑制消减杂交文库的构建与序列分析

前言

5.1材料

5.2方法

5.2.1样品的处理

5.2.2总RNA的获得

5.2.3 mRNA的分离与浓缩

5.2.4抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)

5.2.5差异表达基因消减cDNA文库的构建

5.2.6克隆子的鉴定

5.2.7 cDNA测序与同源性分析

5.3结果与分析

5.3.1总RNA的分析

5.3.2 mRNA的的分离

5.3.3抑制性消减杂交

5.3.4差异表达基因消减cDNA文库的构建

5.3.5克隆子的PCR鉴定

5.3.6 ESTs的同源性分析

5.4 讨论

5.4.1 SSH文库的应用

5.4.2总RNA的提取

5.4.3获得家蝇新基因的方法

5.5小结

总结与展望

本论文的创新点

参考文献

附录Ⅰ缩略词

附录Ⅱ在读期间发表的论文

附录Ⅲ在读期间获得的奖励

致谢

原创性声明