砷诱导转化过程中突变p53的积累导致代谢转变

摘要

【背景及目的】：
　　背景：砷不仅广泛的存在于自然界中，而且在人类生产活动中，例如采矿，杀虫剂，合金，玻璃，电子零部件的工业生产中被普遍使用[1]。砷污染被认为是危害人类健康的主要原因之一。不似其他有机污染物，砷不可以被微生物降解并且长期稳定的存在于水和土壤环境中[2]。人们长期生活在这些地区罹患各种各样疾病的概率更高，包括恶性肿瘤。通常而言，带正电的类金属砷离子容易通过被动转运渗透进入细胞并且代谢形成毒性更高的甲基或二甲基砷[3]。不仅如此，研究表明砷损坏了细胞正常的氧化还原功能，导致上皮细胞的代谢转变，例如肺脏，皮肤，肝脏的上皮细胞[4]。长期暴露于被砷污染的环境能够诱发肿瘤产生的报导日益受到关注。我们实验室在体外建立了一个模型来模拟砷转化的进程并进以研究糖代谢相关酶和上皮细胞间充质转化在不同时间点上的的代谢改变。另外，我们通过缺氧诱导因子HIF-1α及糖代谢相关酶在沉默实验后蛋白水平的变化，研究缺氧诱导因子对糖代谢的影响。为了进一步研究肿瘤抑制因子p53对转化过程的影响，我们进行了p53的DNA测序和限制性内切酶实验。通过检测N-钙粘着蛋白和E-钙粘着蛋白的表达来了解上皮细胞间充质转化过程的起始。通过这些数据我们阐明了糖代谢相关酶的的表达的上调是由于突变p53的积累和野生型p53表达的下降。砷引发p53的表达并激活DNA修复和细胞周期阻滞的功能，这解释了最初的糖代谢相关酶的的抑制和上皮细胞间充质转化的现象。当功能失调的p53的量超过细胞所能承受范围的时候，肿瘤开始发生。
　　目的：1、建立体外苯并芘和长期亚砷酸钠协同处理作用下的大鼠肺泡上皮细胞癌化模型。
　　2、验证砷处理的LEC细胞的恶性肿瘤性质和去分化程度。
　　3、研究各转化阶段的代谢途径变化和上皮细胞间充质转化相关蛋白的表达。
　　4、研究功能失调的p53对缺氧诱导因子HIF-1α表达的调控及HIF-1α对糖代谢相关酶表达的影响。
　　5、研究p53对代谢途径尤其是糖代谢的影响。
　　6、研究p53突变的发生和转化细胞中p53的功能。
　　7、阐明砷转化过程中p53对代谢途径影响的介导途径。
　　【材料和方法】：
　　永生化的大鼠肺泡上皮细胞（LEC）分离自成年Fischer-344大鼠肺泡上皮组织，并建立成为稳定的细胞株。实验中，未经处理的LEC细胞作为对照组。在实验组中，LEC细胞先经过100 nM B[a]P处理24小时，然后在含有2.0μM亚砷酸钠的完全培养基中连续培养16周。通过瑞氏-吉姆萨染色法在光学倒置显微镜下观察转化后期的细胞（TLEC）和对照组LEC细胞的形态学差别。通过软琼脂试验和细胞团形成试验分别检测TLEC细胞的非锚定依赖性能力和去分化水平。通过分离软琼脂实验中生长的克隆，我们获得超过20株纯化的恶性转化细胞株。通过检测TLEC不同转化阶段以及单克隆细胞（TMC）的糖代谢和上皮细胞间充质转化相关酶的表达水平探索长期接触砷污染物和癌症发生之间的关系。在缺氧诱导因子HIF-1α的沉默实验中，我们进一步研究了HIF-1α蛋白水平和糖代谢亢进之间的关系。已知致癌物直接或间接导致基因的突变，作为介导细胞损伤修复和凋亡的重要调节因子，p53基因在许多恶性肿瘤中发生突变且高度表达，我们假定TLEC的转化过程和p53功能缺陷有关,通过免疫荧光实验来研究p53蛋白水平在转化细胞中的变化。为了进一步验证假设，我们对单克隆细胞（TMC）p53的cDNA进行测序并进一步通过凝胶迁移实验来比较LEC中野生型p53和TMC中突变型p53对下游DNA结合能力的差别。最后，为了了解突变p53是在转化的什么阶段开始发生的，通过特异性限制性内切酶消化不同时间段转化的和未经内切酶消化过的TLEC基因组中p53,然后对p53进行普通PCR扩增确定其转录情况，以确立p53对整个转化实验影响的中心位置。
　　【结果】：
　　1.通过瑞氏-吉姆萨染色法直接对比对照组的LEC细胞和转化后期TLEC细胞染色后的形态学差别，我们发现转化的细胞形态相对较大，细胞之间的联系减少，细胞形状变得更加不规则，细胞核和细胞质的比例（核质比）显著增大，并伴随多核细胞以及核仁数目的增加。所有上述形态学改变和恶性肿瘤的特性一致。
　　2.对照组LEC细胞和实验组TLEC细胞在软琼脂中培养4周后，我们发现对照组LEC仍然以单个细胞存在，而中大部分转化的细胞形成细胞集落，且部分集落的细胞呈现指数型增殖。
　　3.在细胞成球试验中，对照组LEC细胞和实验组TLEC细胞在无贴壁处理的培养皿和完全培养基的液态环境中培养2周后，我们发现对照组LEC仍然以单个细胞存在，而大部分转化的细胞繁殖形成至少由50个细胞组成的细胞克隆。
　　4.在软琼脂集落形成实验中，我们将繁殖能力强的单细胞长成的集落分离出来，并进一步扩增和再次进行软琼脂集落实验验证细胞的恶性程度，获得了不同恶性程度的单克隆细胞株。另外的实验也证明了我们的砷诱导的转化细胞可以在裸鼠中成瘤（本论文中没有提及）。
　　5.通过免疫荧光实验对对照组LEC和实验组TLEC细胞中p53蛋白的定位和定量分析比较，我们发现转化后的细胞p53蛋白水平显著上升并集中聚集于细胞核中。
　　6.通过免疫印迹实验对对照组LEC，不同转化时期的TLEC及6种单克隆细胞的糖代谢相关酶和上皮细胞间充质转化（EMT）相关蛋白表达水平的检测，我们发现已经转化的细胞的代谢活化且EMT相关酶的表达符合常见肿瘤中同蛋白的变化。
　　7.抗癌药顺铂处理的p53下游基因表达和活性检测中，转化促使细胞对顺铂诱导的DNA损伤失去敏感性并产生较强的抗性。
　　8.通过p53的cDNA测序实验发现由TLEC分离得到的单克隆细胞（命名为TMC细胞株系）的p53基因拥有共同的点突变，并在密码子水平上产生有义突变，直接导致p53蛋白高级结构及功能上的改变。
　　9.在缺氧诱导因子HIF-1α的沉默实验中，转化细胞TLEC的缺氧诱导因子HIF-1α沉默后，发现TLEC中原本较高的糖代谢相关蛋白表达下调。
　　10.对转化不同阶段的TLEC细胞的基因组DNA用特异性限制性内切酶消化正常p53基因和未消化前的总p53水平进行比较，我们发现突变型p53在转化后期迅速聚集起来。
　　11.通过合成生物素标记的p53结合序列保守DNA片段，在EMSA实验中，我们发现突变型p53对DNA的结合能力相对于正常p53减弱了许多。
　　【结论】：
　　通过苯并芘和长期的砷处理，我们成功建立体外砷转化大鼠肺泡上皮细胞LEC模型并获得具有恶性肿瘤细胞性质的单克隆细胞株。我们从以下四大方面研究并确定了砷转化细胞TLEC的性质：
　　1.在形态学上，TLEC的细胞形状趋向间充质细胞、细胞核和核仁数目增加，细胞呈现酸性转变。
　　2.在细胞的贴壁能力和分化水平上，TLEC尤其是转化的单克隆细胞株具有不同程度的非贴壁依赖性和去分化水平，并能形成由单个细胞繁殖而成的细胞球。
　　3.在细胞的代谢方面，通过LEC和转化后的TLEC及大克隆细胞株的比较，转化的细胞在代谢上趋向于恶性肿瘤细胞的代谢偏好，包括上调的糖酵解速率，蛋白质和核酸合成以及减弱的脂类合成。
　　4.在肿瘤抑制因子p53方面的研究，我们确定了转化细胞中高水平的p53发生突变并发生功能失调，而且确定了突变p53在转化的过程中逐渐积累并影响细胞代谢。
　　综合以上发现，我们确定了p53在转化过程中发生突变并逐渐积累。因为野生型p53通过TIGAR调控糖酵解速率，故砷转化过程中p53的突变以及对糖代谢的异常产生重要影响。

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目录

第一章 前言

第二章 实验材料

2.1 细胞株

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器与设备

第三章 实验方法

3.1 细胞培养和砷处理

3.2 细胞形态学观察

3.3 软琼脂集落形成实验

3.4 细胞成球试验

3.5 免疫印迹实验

3.6 RT-PCR

3.7 DNA测序

3.8 细胞活力检测

3.9 免疫荧光实验

3.10 基因组DNA的提取（血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒）

3.11 凝胶迁移实验

3.12 染色体核型分析

3.13 细胞划痕实验

3.14 siRNA沉默实验

3.15 特异性限制性内切酶消化实验

3.16 统计数据处理

第四章 实验结果

4.1长期砷处理诱导的形态学变化

4.2 免疫印迹实验检测代谢变化

4.3 免疫印迹实验检测上皮细胞间充质转化

4.4 顺铂检测转化细胞的敏感性

4.5 基因沉默实验验证HIF-1α与糖代谢之间的关系

4.6 转化细胞 p53 功能的损伤

4.7 限制性内切突变p53在转化过程中聚集

第五章 讨论

第六章 结论

【结论】

【创新】

【不足】

参考文献

附录

附录一: 试剂配制

附录二蛋白标准曲线

附录三：免疫印迹实验蛋白抗体清单

致谢

个人简历

研究生期间论文发表情况