苦瓜皂苷双水相分离纯化及其降糖活性与构效关系解析

摘要

苦瓜中的皂苷主要含有甾体类皂苷和三萜类皂苷，据报道其具有抗肿瘤、提高免疫、降血糖、抑菌、抗病毒等功能，尤其其降糖的功能活性受到较多的关注。双水相系统具有温和液相环境，能进行连续分离操作；易于产业化和扩大化等优点，可用于混合物中萃取蛋白质，多糖，皂苷及其它生物活性分子。大孔吸附树脂，具有大孔结构的高分子吸附剂，又具有网状结构和很高的比表面积，在对皂苷粗提物的纯化，除去水溶性多糖、色素等杂质上显出了独特的效果，近年来在医药领域中广为应用。本论文主要研究低分子醇/盐双水相萃取结合大孔树脂层析分离纯化具有高降糖活性的苦瓜皂苷，并对分离得到的苦瓜皂苷结构特征与降糖活性之间的关系进行解析与探讨。主要研究结果如下：
　　（1）对乙醇浸提苦瓜皂苷的条件进行响应面优化设计。首先通过单因素（乙醇浓度、温度和液料比）实验获得最佳提取条件；然后根据单因素实验结果设置三因素三水平实验，重复3次，得出响应面优化结果：乙醇浓度为66％，提取温度为82℃，液料比为74:1时，最大得率Y=4.27%，进一步对该优化的实验条件进行验证，获得苦瓜皂苷得率为4.24%，与模型预测得率相差0.03%，这说明该响应面优化设计可以很好的应用于苦瓜皂苷提取优化。
　　（2）通过上述优化后的浸提实验条件处理，获得的苦瓜皂苷通过双水相体系进一步富集分离。首先，确定双水相体系的相平衡数据，其次，考察双水相体系类型（乙醇/(NH4)2SO4体系，异丙醇/(NH4)2SO4体系，PEG600/2000/(NH4)2SO4体系），系线长度（TLL=25，30，35，40，45，50，83）和相比（R=0.4，0.8，1，1.2，2.5，3）对苦瓜皂苷分离纯化性能的影响，采用香草醛-72%硫酸法测定两相中的皂苷浓度，苯酚硫酸法测定多糖残留，结果显示，乙醇/(NH4)2SO4,异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系在苦瓜皂苷的富集和多糖的去除方面优于其他体系，表明这两种双水相体系都可以用于苦瓜皂苷的分离提取。
　　（3）双水相体系萃取是一个初级富集分离过程，为使苦瓜皂苷的纯度和降糖活性达到更高的技术标准，本论文尝试将双水相体系结合大孔树脂纯化苦瓜皂苷，首先对大孔树脂静态吸附苦瓜皂苷的特性做了一些研究，考察时间、皂苷浓度、温度、双水相体系对大孔树脂静态吸附量的影响，结果表明，在8h时大孔树脂对苦瓜皂苷可以达到趋近饱和的状态，对皂苷的静态饱和吸附量为250.312mg/g；温度在0℃-40℃范围内时，随着温度的升高，吸附量在增大，但变化不明显；乙醇浓度在0-60%范围内，PEG600浓度在0-30%范围内，(NH4)2SO4浓度在0-1mol/L范围内，随着乙醇浓度、PEG600浓度的升高，吸附量在降低，随着(NH4)2SO4浓度的升高，吸附量变化不明显，初步判断乙醇、PEG600不利于大孔树脂对皂苷进行吸附，(NH4)2SO4对其没有影响。其次，大孔树脂动态吸附和洗脱方面做了一些研究，首先使用传统方法，单独采用大孔树脂层析技术纯化皂苷，分离出六种不同极性的皂苷组分，研究发现极性较低的皂苷组分的降糖活性高，基于这个结果，希望借助双水相体系富集纯化极性较低的组分，实验中将对大孔树脂层析、乙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析、异丙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析技术分离纯化苦瓜皂苷这三种方法做了比较研究，结果表明，乙醇/(NH4)2SO4体系、异丙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析技术所得到的洗脱曲线的峰宽均窄于大孔树脂分离方法，苦瓜皂苷得率（分别为15.1mg/g、8mg/g）均大于大孔树脂分离方法（Y=5.65mg/g），且异丙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析技术分离纯化的皂苷组分属于极性较低的组分。
　　（4）把大孔树脂层析、乙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析、异丙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析技术这三种方法所得的苦瓜皂苷进行降糖活性比较、红外光谱分析、高效液相检测等。通过对α-葡萄糖苷酶抑制作用测定其降糖活性。实验结果表明，乙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析、异丙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析技术所得到的苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度IC50分别为80μg/mL，50μg/mL，远低于单独采用大孔树脂分离方法得到皂苷的IC50（380μg/mL），说明前两者具有更高的降糖活性。红外光谱分析结果显示，而后一种方法所得皂苷所含有的-CH3，-CHO数目大于前两种，与文献中已有的结构式对照，初步判断这三种方法所得皂苷为葫芦烷型四环三萜皂苷，根据结构显示，后一种方法所得皂苷的极性小于前两种，而且其含有醛基基团，与之前的降糖活性分析相结合，推测其极性小、含有醛基等特征可能是其降糖活性较高的原因。高效液相检测结果显示，从
　　峰数量和峰面积上可以看出，乙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂层析技术所得的皂苷比单独采用大孔树脂层析技术得到的纯度要高一些。从这三种皂苷所显示的色谱图中可以看出，在几种响应值较高的峰中极性较小的组分在异丙醇/(NH4)2SO4体系结合大孔树脂所得皂苷中含量较大，与之前的降糖活性分析相结合，说明后一种皂苷的降糖活性较高的原因是含有极性较小的皂苷组分多。

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第1章 引言

1.1苦瓜的研究进展

1.2苦瓜皂苷的研究现状

1.3研究目的，意义和主要内容

第2章 苦瓜皂苷的提取工艺

2.1前言

2.2实验材料与仪器

2.3实验方法

2.4实验结果

2.5总结

第3章 双水相体系筛选

3.1前言

3.2实验材料与仪器

3.3实验方法

3.4实验结果

3.5总结

第4章 大孔吸附树脂分离纯化苦瓜皂苷

4.1前言

4.2实验材料与仪器

4.3实验方法

4.4结果与讨论

4.5总结

第5章 苦瓜皂苷降糖活性研究及结构鉴定

5.1前言

5.2实验材料和仪器

5.3实验方法

5.4结果与讨论

5.5总结

第6章 结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

致谢