儿童急性白血病γ-谷氨酰水解酶DNA甲基化和microRNA调控研究

摘要

目的：甲氨喋呤（MTX）是急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿巩固期重要的化疗药物，γ-谷氨酰水解酶（GGH）是细胞内MTX代谢的关键酶。GGH活性受基因多态性、染色体核型和表观遗传学等因素影响，目前有关GGH基因多态性和染色体核型的研究已较深入，而表观遗传学尤其是 DNA甲基化和 microRNA（miRNA）调控的研究却罕见报道。本研究拟探讨 ALL和急性髓细胞白血病（AML）细胞中GGH基因启动子区CpG岛的甲基化改变与GGH mRNA表达的关系，分析CpG岛甲基化改变与MTX临床毒副作用的相关性，并对miRNA对GGH mRNA表达的影响进行初步研究。
　　方法：收集68例非超二倍体B-ALL、29例AML骨髓样本作为研究对象，另收集10例免疫性血小板减少性紫癜（ITP）骨髓标本，40例健康儿童外周血样本作为对照，分别提取骨髓或外周血基因组DNA、总RNA、miRNA。采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）结合重亚硫酸盐PCR测序法（BSP）对GGH基因启动子区两个CpG岛（CpG1和CpG2）进行甲基化检测分析，荧光定量PCR测定GGH mRNA及miR-26b-5p的水平，HRM方法筛查GGH基因3′端非编码区（3’UTR）的单核苷酸多态性（SNP)。按世界卫生组织化疗毒副作用分级标准收集ALL患儿MTX毒副作用临床资料，统计分析GGH不同CpG岛甲基化改变和MTX毒副作用的相关性。
　　结果：
　　(1) ALL和AML儿童白血病细胞的CpG1岛甲基化发生率分别为30.9％（21/68）和20.7%（6/29），对照组未检出CpG1岛甲基化。ALL和AML儿童白血病细胞的CpG2岛甲基化发生率分别为44.1%（30/68）和37.9%（11/29），远高于对照组的6.0%（3/50）(Fisher确切概率法：P=0.000)。
　　(2) CpG1岛甲基化或CpG2岛超甲基化（甲基化水平大于10%）可明显降低ALL和AML儿童白血病细胞中GGH mRNA表达（ALL-CpG1:t=4.632, P=0.000;ALL-CpG2:t=3.250, P=0.006;AML-CpG1:t=-2.254, P=0.037;AML-CpG2:t=1.328, P=0.202），2个CpG岛均发生甲基化时影响最大。
　　(3)对照组外周血白细胞中的miR-26b-5p与GGH mRNA表达呈负相关，外周血白细胞miR-26b-5p表达水平高于各组骨髓细胞，与GGH mRNA在两组标本中表达相反，提示miR-26b-5p可能对GGH mRNA的表达发挥下调作用；GGH不同CpG岛甲基化改变和MTX毒副作用未发现有意义的关联。
　　(4)首次在中国健康儿童和白血病患儿中确定 GGH基因3′UTR的SNP1385T>C(rs17279558)的等位基因频率，分别是10.3%和11.0%，两组间差异无统计学意义，未发现其调节功能。
　　结论：
　　(1)研究证实儿童白血病中GGH基因启动子区CpG岛甲基化现象常见， CpG1岛甲基化为白血病细胞所特有，CpG2岛甲基化频率明显高于正常儿童。
　　(2) CpG1岛甲基化和CpG2岛超甲基化可显著降低GGH表达水平，2个CpG岛均发生甲基化时影响最大，GGH启动子区CpG甲基化可一定程度影响GGH表达。
　　(3)正常儿童中发现miR-26b-5p水平和GGH表达水平存在负相关，提示miR-26b-5p水平可能对GGH表达发挥下调作用。
　　(4)在中国白血病患儿和健康儿童中首次鉴定GGH基因3′UTR下游的SNP1385T>C(rs17279558)及其等位基因频率，未发现其调节功能。
　　(5)本研究提示:表观遗传学通过启动子区CpG岛甲基化和miR-26b-5p表达水平的变化对GGH表达的调节可能改变MTX的代谢而影响急性白血病的疗效，为急性白血病个体化治疗方案的制定丰富了理论依据。

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第一章 前 言

第二章 对象与方法

2.1 研究对象

2.2 研究内容

2.3 主要仪器及试剂

2.4 实验方法

2.5 统计学分析

第三章 结果

3.1 GGH基因启动子区域甲基化分析结果

3.2 GGH表达水平和CpG岛甲基化关联分析

3.3 ALL组治疗前后GGH基因CpG岛甲基化变化分析

3.4 ALL组治疗前后GGH表达水平变化分析

3.5 甲基化改变和白血病患儿临床特点及MTX毒副作用

3.6 miR-26b-5p水平和GGH表达水平相关性分析

3.7 miR-26b-5p结合区域SNP分析

第四章 讨 论

结语

参考文献

附录1 英文缩略词表

附录2 攻读硕士学位期间发表论文情况

附录3 综述:儿童白血病化疗药物基因组学研究进展

后记

个人简历