携带人内皮抑素基因腺病毒质粒的构建及相关功能的研究

摘要

研究背景 子宫内膜异位症(Endometriosis，简称内异症或EMs)是一种雌激素依赖性疾病，其真正的病因和发病机制还不明确。目前临床上治疗的主要目标只局限于减轻疼痛，提高妊娠率以及尽可能的延迟疾病复发，尚不存在针对病因治疗的药物，疾病也无法得到根治。腹腔镜手术治疗内异症，是目前外科治疗的方法之一，但在轻中度病变、不孕和复发患者中手术的价值还存在争议。在内异症发病机制的研究中，目前普遍接受的观点是1927年Sampson等提出的“种植学说”，指出异位灶必须在新生血管的支持下才能维持内膜的生存和发展。血管生成机制已成为内异症公认的重要发病机制之一。 内皮抑素(Endostatin)是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子，它能特异地抑制血管内皮细胞增殖，这预示着其在内异症治疗中具有的巨大潜力。 目前对于内皮抑素用于抗肿瘤血管生成的研究备受关注，且其蛋白治疗在国外已进入到Ⅱ期临床试验阶段，但由于内皮抑素蛋白质结构不稳定，半衰期短，需多次重复给药，且其生产工艺复杂，这些都大大限制了其应用。如果能采取基因治疗的策略，使机体本身变成一个生产内皮抑素蛋白的“工厂”，就可能彻底解决上述问题。腺病毒载体的应用为内皮抑素实现基因治疗提供了一个很好的途径，被广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。 目的 为深入研究内皮抑素在子宫内膜异位症治疗中的疗效，我们拟构建包含人内皮抑素(hEndostatin)基因的缺陷型腺病毒质粒，利用相应的包装细胞系，制备具有感染能力的腺病毒颗粒，去感染与血管生成密切相关的血管内皮细胞，观察对内皮细胞的影响，验证并探讨其功能和作用机制，为进一步研究内皮抑素在子宫内膜异位症动物模型上的治疗作用打下基础。 方法与结果 1．用基因工程方法获得人内皮抑素基因，设计特定限制性酶切位点，将内皮抑素基因插入缺陷型腺病毒载体中。构建的重组质粒经测序验证，所获得目的基因序列与已发表的人内皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸编码碱基由G突变为A，但编码的氨基酸都是精氨酸，与GenBank中人内皮抑素蛋白质序列完全一致，属于沉默突变型，不影响后续表达。 2．将重组腺病毒质粒线性化后通过Lipofectamine 2000转染HEK293T细胞，得到包含人内皮抑素基因的完整腺病毒颗粒，通过氯化铯密度梯度离心法加以纯化后，用OD260法测定其病毒滴度为5.2×10<'9>pFU/mL。 3．利用构建好的重组人内皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304脐静脉内皮细胞，western blot测定hEndostatin蛋白的表达情况，流式细胞术检测Ad-hEndo引起ECV-304细胞凋亡的情况，绘制Ad-hEndo感染后的ECV-304细胞生长曲线。与对照组相比，病毒感染48小时后检测到明显的hEndostatin蛋白表达，流式细胞术证实Ad-hEndo在感染3d后出现ECV-304细胞凋亡，细胞生长曲线监测显示ECV-304细胞在Ad-hEndo感染后生长受到明显限制。 结论 通过构建包含人内皮抑素基因Human Endostatin的缺陷型腺病毒质粒，利用相应的包装细胞系，制备具有感染能力的腺病毒Ad-hEndo，Ad-hEndo感染的ECV-304脐静脉内皮细胞能有效表达hEndostatin，hEndostatin能诱导ECV-304细胞发生细胞凋亡现象，明显抑制其生长增殖。该研究将为进一步探讨含人内皮抑素腺病毒在子宫内膜异位症动物模型中的治疗作用奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章人内皮抑素基因缺陷型腺病毒质粒Adeno-endo的构建

一、材料与方法

(一)材料

(二)方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第二章完整腺病毒颗粒的制备

一、材料与方法

(一)材料

(二)方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第三章重组腺病毒颗粒的相关功能研究

一、材料与方法

(一)材料

(二)方法

二、结果与分析

三、讨论

四、小结

总结与展望

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢