CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16、CXCL1在正常人和肝纤维化与肝硬化患者肝脏组织内的表达变化

摘要

背景和目的：
　　 由乙型肝炎病毒等因为引起的终末期肝病严重威胁着人类的健康,损伤的肝脏细胞无法发挥正常功能,肝脏移植是目前最为有效的治疗手段,但在临床工作中,肝脏移植的广泛运用受到供体来源匮乏等因素的限制。寻找一种能够替代肝脏移植的治疗方法,让被破坏的肝脏细胞得以自行修复和再生,恢复其正常功能,一直是肝病学家的梦想。
　　 肝脏再生的确切机制至今尚未明确,研究的重点在于找到启动和调节再生的因素。这种因素可能是一些化学物质或生物因子,引起或促进残留肝细胞的分裂增殖；也可能是肝细胞的破坏减少导致正常存在的某些抑制因子浓度下降而启动肝脏细胞分裂。
　　 近年来,应用骨髓源性肝干细胞(bone marrow derived liver stem cell,BMDLSC)治疗终末期肝病是国内外学者的研究热点,而且显示出一定的应用前景。BMDLSC可以恢复因病变而减少的肝细胞数量,修复因病变而破坏了的肝组织结构,使肝脏再生。
　　 BMDLSC在生理状态下定居在骨髓,它向肝内归巢的机制不明确。从理论上讲,应该与白细胞向炎性病灶聚集的机制有相似之处。也就是说,在BMDLSC向肝内归巢的过程中,趋化因子及其受体系统应该起着重要作用。
　　 迄今发现的的趋化因子,根据其N端半胱氨酸残基的位置和数目可分为4个亚族:C-、CC-、CXC-和CX3C-。其中,CXC类趋化因子亚家族包括CXCL1-CXCL16共16个成员,CX3C类趋化因子亚家族只有一个成员Fractalkine,系统命名为CX3CL1。国内外众多学者的研究证明,部分趋化因子及其受体系统在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC)的定向迁移过程中起作用。目前研究的最多的是基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1),它是一种可趋化CXCR4阳性的BMMSC的因子。SDF-1/CXCR4相互作用参与干细胞的迁移和向肝细胞分化的过程。但是,关于其他趋化因子在肝脏疾病进程中的作用,特别是趋化BMMSC迁移至肝脏修复损伤的研究报道却非常少。综观已有的文献资料,CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine等趋化因子的作用也值得重视,因为在体外实验中,这些趋化因子都可以驱使BMMSC向浓度递增方向迁移。但在人体内,这些趋化因子在肝组织中有无表达、在不同病理状态下的表达有何变化、在BMDLSC迁移至肝脏修复损伤过程中起何作用都不清楚,目前也无这方面的报道。本研究对趋化因子CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine在正常肝组织和肝纤维化与肝硬化组织中的含量进行了观察,从一个新的角度对这些趋化因子促使BMDLSC迁移至肝脏修复损伤的作用提供理论依据。
　　 材料和方法：
　　 1.研究对象
　　 人肝脏组织,样本量为30例,男性17例,女性13例。年龄19～77(平均50)岁。标本均来自2008年05月～2009年05月在南方医科大学南方医院肝胆外科接受手术(包括肝移植)的患者。肝组织标本在手术中获取,肝组织切取后立即分为两份,一份甲醛固定后行组织病理学检查,另一部分放入1.5 mL EP管内置于-80℃低温冰箱保存待测。
　　 2.标本分组
　　 ①正常对照组(n=9):患者无乙型肝炎病史,乙型肝炎两对半显示乙型肝炎表面抗原阴性,肝组织病理学检查显示肝组织结构正常。
　　 ②肝纤维化组(n=10):患者有乙型肝炎病史或乙型肝炎病毒感染史,乙型肝炎两对半显示乙型肝炎表面抗原阳性,组织病理学检查显示肝内纤维组织广泛增生,但未见假小叶形成。
　　 ③肝硬化组(n=11):患者有乙型肝炎病史或乙型肝炎病毒感染史,乙型肝炎两对半显示乙型肝炎表面抗原阳性,肝组织病理学检查提示肝内纤维组织广泛增生,并有假小叶形成。
　　 3.观察指标
　　 3.1临床症状与体征
　　 询问病史和体格检查以确认患者有无黄疸,有无肝掌与痴蛛痣,有无腹腔积液,有无肝性脑病等,以及这些症状体征的程度。
　　 3.2影像学检查
　　 行肝脏腹腔B型超声检查和肝脏CT扫描。
　　 3.3实验室检查
　　 行乙肝两对半、丙肝抗体试验；手术当天抽血化验查肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TBIL)、凝血酶原时间(PT)。
　　 3.4组织病理学检查
　　 肝组织经固定,常规石蜡包埋与切片,HE染色后,光学显微镜下观察。
　　 4.肝组织中趋化因子CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine含量的测定
　　 4.1肝组织的匀浆、离心
　　 肝组织经电子天平称重后移入微量手动玻璃匀浆器中于冰水中匀浆5min,然后按1/8质量体积比加入1xPBS缓冲液将匀浆组织洗下并转移至1.5ml EP管中,再稀释一倍后,低温高速离心机4℃下1000xg离心10min,提取上清液移至另一1.5ml EP管中,低温高速离心机4℃下25000r/min离心20min,取上清液分别测定CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine浓度。
　　 4.2 ELISA法测定趋化因子的含量
　　 采用双抗体夹心ELISA法,已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将趋化因子和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用,产生颜色。在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值。根据标准品的浓度与其OD值,用SPSS统计软件进行曲线拟合,得到拟合效果最佳的标准曲线以及标准曲线方程,最后计算出标本离心液中的趋化因子的浓度。
　　 5.统计学分析
　　 数据均以(x)±s表示,应用SPSS13.0统计软件分析。行x列表资料采用x2检验；多组均数方差齐性,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD两两比较；多组均数方差不齐,采用Welch近似方差分析及Dunnett’s T3两两比较。相关分析数据符合双变量正态分布采用Pearson相关系数表示,不符合双变量正态分布的采用Spearman相关系数表示。统计分析中,检验标准为α=0.05。
　　 结论
　　 1.趋化因子CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine在正常肝组织中有表达。
　　 2.肝脏发生纤维化损伤时,肝组织中CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine的表达数量增多,但它们的变化规律不同。肝内CXCL5、CXCL13水平在肝纤维化阶段开始升高,至肝硬化阶段升高到显著水平。肝内CXCL8、CXCL16、Fractalkine水平在肝纤维化阶段就已经升高到显著水平,至肝硬化阶段仍维持在高水平状态。提示CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine在肝病损伤诱发的BMMSC向肝脏迁移方面很可能有所作用,但作用环节很可能不同。
　　 3.肝组织中CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和Fractalkine的含量与部分肝功能指标的变化呈显著相关,但相关系数都在0.7以下,提示这些趋化因子的变化与肝脏的疾病损伤有关,但变化程度与肝病的损害程度不全一致。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 病例的选择与分组

1 、材料与方法

2 、结果

3 、讨论

第二章 肝脏组织内CXCL5、CXCL8、CXCL13、CXCL16和CX3CL1含量的测定

1 、材料与方法

2 、结果

3 、讨论

4 、结论

参考文献

综述

参考文献

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致谢

统计学证明