新型混合性生物人工肝体外功能和安全性研究

摘要

急性肝衰蝎,病情危笃,进展迅速,预后凶险,是临床亟待解决的治疗难题。尽管近年来内科综合治疗措施取得了较大进展,患者病死率依然高达50-80％。肝移植可以显著降低肝衰竭患者病死率,但由于供肝严重短缺,事实上仅有不足1/3的患者接受了肝移植手术,而大多数患者在等待供肝的过程中死亡。基于此种前提下,国内外学者设计、构建了不同类型的人工肝系统,希冀借助一种体外的机械、理化或者生物的装置,清除患者体内蓄积的各种有害物质,补充必需物质,改善内环境,暂时替代衰竭肝脏的部分功能,为肝衰竭患者肝细胞再生及肝功能恢复创造条件,或等待供肝进行肝移植,从而降低患者病亡率。
　　 经过50余年的发展,目前人工肝支持系统(artificial liver support system,ALSS)治疗技术已逐渐成熟,基本形成三大类十几种方法,国外多数学者按照人工肝的组成和性质分为以下三类:(1)非生物型人工肝；(2)生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)；(3)混合型生物人工肝(hybrid bioartificial liver,HAL)。其中,HAL 代表着人工肝的发展方向。
　　 无论是 BAL 还是 HAL,肝细胞都是其核心原材料,对肝功能衰竭患者的肝支持作用几乎完全依赖于所用肝细胞的生物学功能。BAL 和HBAL 细胞来源种类较多,但目前尚未有一种可以完全满足临床的需要,如人肝细胞来源的匾乏、胎肝细胞的伦理问题、肝细胞株的瘤源性等因为、猪肝细胞潜在的异种细胞免疫反应、合成的蛋白质种属差异和猪体内普遍存在着内源性反转录病毒(procineendogenous retroviral,PERV)。我们的前期研究发现,中国人肝细胞系 CL-1 细胞分化程度高且生物代谢功能良好,并且 CL-1 细胞组织学上来源于正常肝组织,较其他来源于肿瘤源性的肝细胞系更为安全,但是目前尚未对 CL-1 细胞作为种子细胞的BAL 和HAL 进行研究。
　　 迄今已有 4 种 BAL 或 HAL 系统业已开始进行Ⅱ-Ⅲ期临床验证,其中大多采用中空纤维管型生物反应器,氧合的血浆流经中空纤维内腔以供应肝细胞氧气和营养物质。初步结果证明这些治疗是安全、有效的,没有明显的不良事件出现。但是,由于血浆携氧能力不足全血的10％,因此,这些系统的氧供远不能满足肝细胞的需要,很大部分的肝细胞可能处于缺氧状态,进而导致肝细胞活性降低和肝细胞功能不良,最终导致这些人工肝系统的疗效降低,并且中空纤维反应器中肝细胞分御不均匀,细胞粘附能力差,膜的污染和堵塞,细胞生长或过量气体产生会破坏纤维,既影响细胞功能的发挥又影响对生物反应器内细胞功能状态的观察。
　　 为解决生物反应器中肝细胞缺氧问题,我们与中科院共同研制了一种全接触灌流型生物反应器。该反应器采用双进口和双出口的透明有机塑料制成,并且这种反应器在治疗时做180度的往返旋转运动,生物反应器中的肝细胞与血浆直接接触,可以充分的发挥肝细胞的代谢和生物转化功能,并且 HAL 系统的生物部分有独立的共给氧气的装置,氧气通过膜式氧合器进入血清中,供给反应器中的肝细胞,以保证生物反应器中的肝细胞得到充分的氧气供应。
　　 本研究中,我们以这种全接触灌流型生物反应器接种微载体微重力肝细胞共培养至第五天的CL-1 细胞,结合非生物部分的血浆灌流器,生物反应箱、蠕动泵、膜式氧合器等构建了一种简单、新颖的HAL,并用模拟肝衰竭血清(专利公开号:CN101556275)对其进行疗效和安全性评价。具体包括以下三部分研究内容:
　　 一；配置一种可以在常温下稳定保存的、能够反映部分肝衰竭患者血清成分变化的组合物；
　　 二:混合型生物人工肝的构建和评价；
　　 三:CL-1 细胞作为种子细胞安全性的研究。
　　 第一部分 模拟肝衰竭血清的配置及其稳定性研究
　　 目的:依据临床上肝功能衰竭时血清成分变化的主要特点,研制一种可用于体外检测混合型生物人工肝支持功能的组合物。
　　 方法:(1)以未结合胆红素,鹅去氧胆酸,胆酸和氯化铵为组合物中的主要成分,将其先后溶解胎牛血清浓度为 10％DMEM 细胞培养基中,并使未结合胆红素,鹅去氧胆酸,胆酸和氯化铵的浓度分别在 171-342μmol/L、80-160μmol/L、20-40 μmol/L 和240-400μmol/L 范围内；(2)先将未结合胆红素制备成胆红素二钠后,再将其与鹅去氧胆酸,胆酸、氯化铵按照上述同样浓度范围先后溶解在 DMEM 细胞培养基中。上述两种不同方法配制的组合物放置在37.5℃的环境中,分别检测其在0,12和24小时组合物中各物质的浓度。
　　 结果:在37.5℃时,按上述两种方法配置的组合物中各物质在0、24和48h性质稳定,浓度变化无显著性差异(P>0.05)。
　　 结论:所配置的组合物性质稳定,能够在同一基线水平检测生物人工肝的体外功能。
　　 第二部分
　　 目的:本研究旨在设计一种新型混合型生物人工肝,并通过对模拟肝衰竭血清的净化作用评价其疗效,探讨其临床应用的可行性。
　　 材料和方法:整个 HAL的设计采用血液灌流+生物人工肝模式,非生物部分通过血浆分离后进入血液灌流器中,经过灌流后的血液在通过蠕动泵部分进入生物反应器中,生物反应器部分置于 37.5℃的恒温环境中,生物部分通过膜式氧合器供给反应器中肝细胞,氧气和二氧化碳气体时间比约为 110:10(即 2分钟内通氧气 110s,通二氧化碳 10s),模拟肝衰竭血清经过肝细胞代谢后,在通过二次分浆回流至非生物部分,整个系统的预冲量约为 800ml.其中灌流型生物反应器的预冲量约为 300ml.,整个系统通过两套聚乙烯胶管构成一个封闭的环路。
　　 选用中国人肝细胞系 1(CL-1)作为肝细胞供体,采用微载体微重力肝细胞共培养方法培养至第五天,灌入反应器中,制成生物部分(细胞总量约为4.0×109,细胞密度约为4.0×107/ml)。
　　 观察整个治疗过程中有无液体渗漏,动态监测模拟肝衰竭血清中未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸和血氨浓度的变化以及肝细胞对利多卡因代谢产物的检测,此外每过 24h 取样计数反应器中肝细胞数量和肝细胞的状态,MTT 法检测肝细胞活性。
　　 结果:整个治疗过程中未发现管路中有液体渗漏；循环前 24h 内,模拟肝衰竭血清中未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸和血氨的浓度呈直线型下降,与0h 相比有统计学意义(P<0.05),24h后浓度下降较平稳；循环 48h 后,CL-1 细胞功能发生变化,生物反应器中模拟肝衰竭血清中的ALT、AST 和LDH 水平明显升高,与 0h 相比有统计学意义(P<0.05)；并且整个反应器中肝细胞的数量和活力在循环 48h 后也呈现显著性下降(P<0.05)。
　　 结论:1、构建了一种新型灌流型生物反应器。该生物反应器中的CL-1 细胞能够保持较高的活性和良好的功能。
　　 2、构建了一种新型混合生物型人工肝。该型人工肝可以显著降低模拟肝衰竭血清中的毒性物质的浓度,提示其具有明显的肝支持作用。
　　 第三部分 CL-1 细胞及其细胞碎片致瘤性研究
　　 目的:探讨 CL-1 细胞的安全性
　　 方法:取培养至第五天的CL-1 细胞,以2.5g/L 胰蛋白酶消化后离心,加DMEM 调至细胞密度为 1.0×1010/L,-70℃ 反复冻溶三次,使细胞裂解,将0.2ml含细胞碎片的溶液分别接种到5只裸鼠的颈部、后背部皮下(n=10))。以0.2ml,密度为 1.0×1010/L的CL-1 细胞接种到5只裸鼠的颈部、后背部皮下(n=10),苔盘蓝拒染试验计数活细胞率为 97％,作对照,观察皮下细胞致瘤情况。4 周后切取注射部位瘤组织及肝、肺、脑组织标本,苏木精-伊红(HE)染色镜检。
　　 结果:接种后 4 周后,实验组未见接种部位出现种植瘤,对照组共有 10 个接种部位出现肿瘤,致瘤率为100％.切下裸鼠皮下的种植瘤,大体标本显示:瘤体呈光滑的圆球型,界限清楚,有完整的包膜。肝、肺、脑组织切片染色未发现有转移.
　　 结论:CL-1 细胞可以安全的作为 HBAL 细胞材料。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一章 模拟人肝衰竭血清的研制及其稳定性研究

1.1 材料与试剂

1.2 方法

1.3 结果

1.4 讨论

参考文献

第二章 混合型生物人工肝的体外功能的研究

2.1 材料与试剂

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

参考文献

第三章 混合型生物人工肝安全性研究

3.1 材料与试剂

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

参考文献

综述

参考文献

中英文名词对照与缩写

在读期间论文发表情况

致谢

统计学证明