舒芬太尼固体脂质纳米粒的制备及其外周炎症组织靶向性研究

摘要

背景：十八世纪,Serturner从阿片中分离出吗啡。到十九世纪中叶,纯生物碱而不是天然吗啡制品广泛应用于临床。阿片类药物除了有显著的优点外,它的毒副作用以及潜在成瘾性多年来也已经为人们所熟知。免疫组化及在体杂交分析证实,阿片受体在中枢神经系统各个区域均有表达。这些区域包括杏仁核、中脑网状结构、导水管周围灰质、延脑头端腹内侧。但是,脑内不同部位阿片受体的表达同样与阿片类药物的副作用息息相关。呼吸抑制是阿片类药最严重的副作用,在人体所有作用于μ受体的阿片类药通过对呼吸中枢的直接作用,产生剂量依赖性呼吸抑制。蓝斑是存在于大脑的主要非肾上腺素核,长期应用阿片类药能导致腺苷酸环化酶抑制、蛋白激酶A活性降低,CAMP途径上调。阿片类药耐受性的发生机制可能涉及蛋白激酶信号转导级联反应,通过调节靶基因表达将细胞外信号与细胞的改变联系起来。研究显示,阿片类药物也可通过外周机制产生镇痛作用。在炎症部位浸润的免疫细胞可释放内源性阿片样物质,这些物质对位于初级感觉神经元的阿片受体产生作用。以上研究提示阿片类镇痛药可以对外周的阿片受体产生特异性抗伤害效应,且其外周作用可以避免药物中枢性副作用,如呕吐、呼吸抑制、成瘾等。外周阿片活性在炎性组织中特别明显,考虑到许多疼痛情况都与炎症相关(创伤、术后疼痛、肿瘤疼痛、关节炎),这一事实启发我们能否开发出理想的药物,减少阿片类药物的中枢作用的同时增加阿片类药物的外周作用。
　　 固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticle,SLN)是近年来发展起来的一种新型的纳米胶体载药系统。它以固态的天然或合成的脂类为载体,制成粒径约为50～1000nm的胶体给药体系,将药物包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,靶向运输至特定部位,具有物理稳定性高、药物泄漏慢、毒性低等优点,提高了药物生物利用度、减少了药剂用量,降低了药物的毒副作用。由于其良好的组织相容性,又具备固体聚合物纳米粒的靶向和缓控释特性,同时其规模化生产的技术已经成熟且成本较低,此外还在可降解性和长期稳定性等多个方面显示出优势,因此是一种极有发展前景的新型药物载体制剂,逐渐被越来越多的学者做为药物新剂型研发的基础。
　　 为此,我们在广东省科技计划基金的资助下,以固体脂质纳米粒为药物载体,通过单因素考察和正交实验优化处方及工艺条件,利用改良的乳化蒸发-低温固化技术,将舒芬太尼吸附或包裹于固体脂质中,制备成舒芬太尼固体脂质纳米粒(Sufentanil-loaded solid lipid nanoparticles,SUF-SLN)。在确定舒芬太尼固体脂质纳米粒制备工艺的最优方案后,我们以外观、粒径、电位、包封率及体外稳定性作为质量考察指标对该制剂表征进行了初步考察。建立酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠脑组织中舒芬太尼浓度的方法,以炎性大鼠的炎性组织为靶器官,观察舒芬太尼和舒芬太尼脂质纳米粒在大鼠体内脑、肝、炎性皮肤等重要脏器的不同分布,探讨舒芬太尼固体脂质纳米粒的靶向性。
　　 目的：硬脂酸作为固体脂质材料,以F68和卵磷脂为混合表面活性剂,利用改良的乳化蒸发-低温固化技术,制备舒芬太尼固体脂质纳米粒(Sufentanil-loaded solid lipid nanoparticles,SUF-SLN),并对该制剂表征进行质量考察。建立酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠脑组织中舒芬太尼浓度的方法,为舒芬太尼在机体全身各器官分布的研究提供一种快速、简便的方法。建立炎性大鼠模型,静脉输注舒芬太尼和舒芬太尼脂质纳米粒,观察药物在大鼠体内脑、肝、炎性皮肤等重要脏器的不同分布,探讨舒芬太尼固体脂质纳米粒的靶向性。
　　 方法：1、舒芬太尼固体脂质纳米粒的制备和表征:在制备工艺研究上,根据单因素考察和正交实验设计优化处方,采用硬脂酸作为固体脂质材料,以F68和卵磷脂为混合表面活性剂,利用改良的乳化蒸发-低温固化技术,制备成舒芬太尼固体脂质纳米粒。以外观、粒径、电位、包封率及体外稳定性作为质量考察指标对该制剂表征进行了初步考察。通过扫描电镜观察纳米粒粒径大小和形态；用Zeta-sizer粒径分析仪检测纳米粒粒径大小和电位:用酶联免疫法测定纳米粒中舒芬太尼的包封率。2、酶联免疫吸附法测定大鼠脑组织中舒芬太尼浓度检测方法的建立:按舒芬太尼试剂盒说明,用测定稀释液分别稀释酶标舒芬太尼及清洗液,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化底物四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine,TMB)及重水(H2O2)显色测定大鼠脑组织中舒芬太尼浓度,并考察日内与日间变异系数、回收率、精密度及稳定性。3、舒芬太尼固体脂质纳米粒在大鼠炎性组织中的分布:(1)大鼠左后足底皮下注射福尔马林建立炎性大鼠模型,随机分为福尔马林炎性大鼠组(A组)和空白对照组(B组),A组又分为舒芬太尼固体脂质纳米粒组(A1组)和舒芬太尼组(A2组),B组也分为舒芬太尼固体脂质纳米粒组(B1组)和舒芬太尼组(B2组)。(2)A1组和B1组静脉输注含5μg/kg舒芬太尼固体脂质纳米粒的生理盐水10ml,速率为40ml/h；A2组和B2组静脉输注含5μg/kg舒芬太尼的生理盐水10ml,速率为40ml/h。(3)根据取标本时间点的不同,各组分别于15min、30min和60min于心脏抽血3ml后处死大鼠,取大鼠脑组织、肝组织、炎性组织(B组取皮下组织)1g,-80℃冰箱保存。血液标本高速离心5min((3000r.min-1),,取上层血浆,于-80℃冰箱保存。ELISA试剂盒检测大鼠脑组织、肝组织、炎性组织(B组取皮下组织)和血浆的药物浓度。(4)统计学处理:以SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析,计量资料以(X)±S表示,方差齐时,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,方差不齐时,采用Welch校正F检验,两两比较采用Dunnett's T3检验,计数资料行卡方检验(Fisher确切概率法),分析各处理方式的主效应及交互效应采用析因分析:当P<0.05时,差异有统计学意义。
　　 结果：1、制备的SUF-SLN混悬液呈外观均一、稳定的半透明胶体状分散体系,略带淡蓝色乳光。电镜下基本呈圆形或类圆形,经Zeta-siser3000HS型粒径分析仪检测SUF-SLN混悬液平均粒径为115.4±1.6nm,Zeta电位为-27.3±1.4mv。酶联免疫法测定纳米粒中舒芬太尼的平均包封率为80.21±2.44％,稳定性好。2、舒芬太尼浓度与吸光度值的回归方程为y=1.9684e-1.0789x,R2=0.9937,标准曲线线性范围0.0625～2μg/L,检测限为0.06μg/L。回收率范围在(81.8±11.9)％～(86.9±7.1)％之间,日内与日间变异系数范围分别为(5.0～6.6)％和(4.8～9.6)％,稳定性好。3、不同组间脑匀浆舒芬太尼浓度比较:在15min时点,舒芬太尼在脑匀浆中的浓度,A1组显著低于A2组和B2(P≤0.01),B1组显著低于A2和B2组(P≤0.01)；在30min时点,舒芬太尼在脑匀浆中的浓度,各组间差异均无统计学意义,(P>0.05)；在60min时点,舒芬太尼在脑匀浆中的浓度,A1组显著低于A2组和B2组(P≤0.01),B1组显著低于A2和B2组(P<0.05=和(P≤0.01)。4、不同组间肝匀浆舒芬太尼浓度比较:在15min时点,舒芬太尼在肝匀浆中的浓度,A1组显著低于A2组、B1组和B2组(P≤0.01),A2组显著高于B1组和B2组差异(P≤0.01),B1组显著低于B2组(P<0.05)；在30min时点,舒芬太尼在肝匀浆中的浓度,A1组显著低于A2组、B1组和B2组(P<0.05)或(P≤0.01)；在60min时点,舒芬太尼在肝匀浆中的浓度,A1组显著低于B2组(P≤0.01),A2组显著低于B2组(P<0.05),B1组显著低于B2组(P<0.05)。5、不同组间舒芬太尼血浆浓度比较:在15min、30min和60min时点舒芬太尼血浆浓度各组比较,均无统计学差异(P>0.05)。6、不同组间炎性或皮下组织匀浆液舒芬太尼浓度比较:在15min、30min和60min时点舒芬太尼在炎性组织或皮下组织匀浆液中的浓度各组比较,均无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：1、利用改良的乳化蒸发-低温固化技术制备的舒芬太尼固体脂质纳米粒,经过粒径、电镜、包封率及稳定性考察,外观均一,大小符合要求,包封率及稳定性较好,从而可以获得质量更高的产品,为将来制剂的大规模生产奠定基础。2.用ELISA方法测定大鼠脑组织中舒芬太尼浓度,具有灵敏度较高,简便、快捷的优点。3、大鼠在静脉输注舒芬太尼固体脂质纳米粒或舒芬太尼后,它在脑组织和肝脏中的分布浓度低于舒芬太尼,在血浆、炎性组织或皮下组织匀浆液中的分布在短时间内(1小时)无显著差异。