白芍总苷对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎影响的实验研究

摘要

目的与意义：
　　 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病,被认为是自身免疫性疾病的原型,以血清中出现抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)为代表的多种自身抗体和多器官、多系统受累为主要临床特征。SLE广泛分布于世界各地,全世界的患病率约为17～48/10万[1],我国在上海纺织女工中进行的一次性大系列调查,显示SLE的患病率为70/10万人,女性则高达113/10万人,略高于西方国家。SLE好发于青年女性,多见于15～45岁,男女之比l:7～9[2]。
　　 SLE累及肾脏引起的肾损害即为狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)。LN是SLE最常见且严重的内脏损害,根据临床表现有70％以上的病人肾脏受累,若根据肾组织病理活检,则几乎所有SLE患者均有肾脏损害[3],其肾脏病变的严重程度是直接影响SLE预后的重要因素[4]。LN临床表现复杂多样,轻重不一,可表现为蛋白尿、血尿和管型尿,或伴有高血压、水肿等临床肾损害和肾功能减退的实验依据,临床诊治困难,致使病情逐渐进展,最终部分患者可进展为终末期肾病(end—stage renal disease,ESRD)[5],是SLE主要死亡原因之一。
　　 LN的病因和发病机制还不十分清楚,目前认为是在遗传易感的基础上经环境因素(包括感染、日光照射、气候、食物、药物作用等)、内分泌(主要为雌激素水平,这可能是女性发病率明显高于男性的原因之一)诱发,引起机体的免疫调节功能紊乱,出现T、B淋巴细胞的异常活化、细胞因子网络失衡、补体的激活及细胞凋亡等,导致ANA、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体等多种病理性自身抗体产生和免疫复合物形成。这些自身抗体主要针对核抗原成分,尤其是针对核DNA产生的抗体,形成抗原抗体复合物沉积在靶器官的血管壁上,引发一系列免疫反应,最终导致全身多个器官损害。自身免疫复合物在肾小球沉积后,激活补体,造成炎细胞浸润、凝血因子活化及各种炎症介质释放,从而导致肾脏损害。
　　 现代医学以糖皮质激素、细胞毒药物、多种新方法,如生物制剂、血浆置换、干细胞移植、大剂量免疫球蛋白冲击疗法等治疗LN,取得了一定疗效。但这些药物的复发率高、副作用大、价格昂贵,许多患者往往难以坚持长期治疗,而且由于SLE的复杂性和异质性,单纯干预某一个环节的治疗策略往往难以取得良好效果。而中药是我国医学资源的一大宝库,临床实践证实,中医药具有多部位、多环节和多靶点的整体调节功能,并在提高疗效、改善预后、减少复发、维持病情长期稳定,帮助停用激素或减少激素维持量及副作用等方面有着良好效果,对多基因调控、发病机理复杂、病情多变的LN患者的治疗具有非常重要的意义。
　　 白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)商品名称帕夫林,作为第一个抗炎免疫调节药被正式批准生产上市,用于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的临床治疗。TGP是国内外学者经过多年的研究从传统中药毛莨科植物白芍干燥根中提取的有效成分,主要为一组糖苷类物质,包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等,统称为TGP,其中芍药苷占总苷量的90％以上,是白芍的主要有效成份。药理和临床研究发现,其具有良好的抗炎、镇痛和免疫调节等作用[6-8],且不良反应少,患者耐受性良好。在某些自身免疫疾病的早期及缓解期,不宜应用强效免疫抑制剂或激素治疗的病人,TGP是满意的选择。目前己逐渐应用于系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、干燥综合征等自身免疫性疾病的治疗,在自身免疫性疾病治疗中显示出独特应用价值和良好应用前景,但用于LN的临床报道鲜见,实验研究尚未见报道。
　　 MR-L/lpr小鼠,由美国Jackson实验室的Murphy和Roths在1978年培育成功,是目前研究SLE和LN最常用的自发性动物模型之一。该鼠含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas基因隐性突变[9],出现淋巴细胞增生基因(lymphoproliferation,lpr),自身反应T细胞即有可能逃避胸腺的负选择,大量释放进入外周器官,造成T细胞大量增生,加速了自身免疫反应,出现脾脏及全身淋巴结肿大、多种自身抗体、高丙种球蛋白血症及免疫复合物相关性肾炎,与人类狼疮性肾炎相似。
　　 本项研究拟采用MRL/lpr小鼠为实验对象,观察TGP对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎尿蛋白、血清抗dsDNA抗体、ANA、肾组织病理、脾脏和胸腺指数及一般状况的影响,为进一步探讨TGP的免疫调节作用机理及临床治疗LN提供重要的理论和实验依据。
　　 方法与内容：
　　 1.实验分组:MR-L/lpr小鼠经检疫、适应性饲养1周后,检测MR-L/lpr小鼠抗dsDNA抗体、ANA水平、尿蛋白含量,抗dsDNA抗体、ANA阳性并且尿蛋白≥100mg·dl-1[10]时提示发病,确立模型。采用数字表分组法随机分为模型组和白芍总苷组(TGP),每组10只。按照《人与动物间体表面积折算的等效剂量比值表》计算,TGP组灌胃给予TGP悬液234mg·kg-1,每天1次,连续30d。
　　 2.检测方法:
　　 (1)观察小鼠用药前后精神状态、毛发、摄食、活动等一般情况变化。
　　 (2)用药前、用药后15、30d早晨固定时间称取体重,采用提尾反射法留取尿液置于-80℃冰箱中保存,考马斯亮蓝法集中检测尿蛋白含量。
　　 (3)用药前、用药后15d早晨固定时间尾静脉采血,用药后30d摘眼球取血,离心取血清,置于-80℃冰箱中保存,双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)集中检测血清IgG型抗dsDNA抗体、ANA水平。
　　 (4)用药后30d处死小鼠,取脾脏和胸腺,用滤纸沾干表面血污分别称其湿重,分别计算脾脏指数和胸腺指数。取肾脏,进行固定、石蜡包埋,一侧肾脏苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肾脏病理改变。另一侧肾脏立即置-70℃冷藏箱中保存,备用。
　　 3.统计学分析:采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料以均数±标准差((X)±S)表示,脾脏、胸腺质量及其指数的比较经方差齐性检验,采用两独立样本t检验。体重、尿蛋白、自身抗体的比较经球对称假设检验,采用重复测量设计的方差分析,多重比较采用最小显著差值法(LSD)检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.一般情况:用药前两组小鼠毛发润泽光滑,摄食、活动灵敏。随时间推移,模型组小鼠逐渐出现毛发稀疏散乱、无光泽,个别小鼠颈背部皮毛明显脱落；精神倦怠,喜蜷卧,活动度下降,活动较迟缓,摄食较前减少。TGP组小鼠较轻,毛发欠光泽,活动自如,摄食改变不明显；实验结束时两组均无死亡。
　　 2.体质量:TGP组小鼠体重用药后30d(23.43±3.60)较用药后15d(22.49±4.35)增加,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠体重用药后30d(21.59±2.75)较用药后15d(22.83±3.25)减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 3.脾脏、胸腺质量及其指数:用药后30d,TGP组小鼠脾脏质量及其指数(89.20±47.00)、(4.02±2.38)较模型组降低(132.70±41.40)、(6.31±2.34),差异有统计学意义(P<0.05)。两组小鼠胸腺质量及其指数相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 4.尿蛋白含量:
　　 (1)用药后15、30d,TGP组小鼠尿蛋白含量(100.40±23.89)、(93.79±22.03)较模型组(122.63±14.20)、(127.88±14.03)降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);
　　 (2)TGP组小鼠尿蛋白含量用药后15(100.40±23.89)、30d(93.79±22.03)较用药前(115.61±13.09)降低,差异均有统计学意义(P<0.05)；
　　 (3)模型组小鼠尿蛋白含量用药前后差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 5.IgG型抗dsDNA抗体水平:
　　 (1)用药后30d,TGP组小鼠IgG型抗dsDNA抗体水平(847.80±577.68)较模型组(1893.17±610.33)降低,差异有统计学意义(P<0.01)；
　　 (2)TGP组小鼠抗dsDNA抗体水平用药后30d(847.80±577.68)较用药前(1260.82±942.70)、用药后15d(1278.18±825.16)降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　 (3)模型组小鼠IgG型抗dsDNA抗体水平用药后15(1783.27±829.70)、30d(1893.17±610.33)较用药前(1273.17±767.13)逐渐上升,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。
　　 6.ANA水平:
　　 (1)用药后30d,TGP组小鼠ANA抗体水平(158.76±66.86)较模型组(419.65±162.04)降低,差异有统计学意义(P<0.01);
　　 (2)TGP组小鼠ANA抗体水平用药后15(241.72±105.43)、30d(158.76±66.86)较用药前(385.18±135.91)降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);
　　 (3)模型组小鼠ANA抗体水平用药前后差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 7.肾脏病理:模型组小鼠肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,伴有炎症细胞浸润,基底膜增厚不明显,部分肾小球体积明显增大；肾小管上皮细胞肿胀,空泡样变性,管腔内可见管型。TGP组小鼠较模型组小鼠肾小球及肾间质炎症细胞浸润明显减少,肾小管轻度浊胀。
　　 结论：
　　 1.TGP明显改善MRL/lpr狼疮肾炎小鼠的一般状况,使小鼠体重增加,脾脏肿大减轻,表明TGP可以提高MRL/lpr狼疮肾炎小鼠生存质量,并对免疫器官有一定的保护作用。
　　 2.TGP可以降低血清ANA、抗dsDNA抗体水平,表明TGP对免疫系统具有调节作用。TGP可能通过免疫调节网络的某个通路,抑制自身抗体的产生,降低自身免疫反应引起的抗体水平,从而治疗LN。
　　 3.TGP可以减少MRL/lpr狼疮肾炎小鼠系膜细胞和内皮细胞增生,减轻肾小球的炎症反应和肾小管的损伤,改善肾脏病理改变,降低尿蛋白含量。表明TGP具有延缓病情进展,保护肾脏的作用。
　　 4.TGP对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎具有一定疗效,至于其发挥作用的深层机制,将在以后的研究中进行探讨。