白芍总苷对MRL/lpr狼疮小鼠临床疗效及外周血IL-17、Foxp3 mRNA表达的影响

摘要

研究背景：系统性红斑狼疮(SLE)是一种几乎累及所有器官组织的自身免疫性疾病，有遗传倾向的机体在各种环境因素如紫外线、感染、药物等作用下，自身耐受被打破，自身反应性淋巴细胞募集、活化、增殖，这种级联反应诱导B细胞产生自身抗体，引起自身免疫反应，并最终导致器官组织损伤。B细胞过度活化产生大量针对自身核酸结构不同类型的抗体，包括抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(ds-DNA)、抗单链DNA抗体(ss-DNA)、抗Sm抗体及针对各种细胞成分的其他抗体。这些自身抗体与体内相应抗原结合，形成免疫复合物沉积于皮肤、血管、肾脏、神经系统等器官组织，激活补体引起损伤;部分抗体与红细胞、血小板等细胞的特异表面抗原结合，引起溶血性贫血、血小板减少等表现。
　　 SLE确切的病因和发病机制至今还不十分清楚，自身反应性B淋巴细胞及其产生的自身抗体可能只是SLE免疫反应中的一个终末环节，而不是始动因素。目前对SLE的发病机制的研究更多的集中在以下几个方面:
　　 细胞凋亡异常:凋亡过程本身发生了许多针对自身抗原的修饰，对自身成分的修饰有利于吞噬细胞的清除，但也提高了自身抗原的免疫原性，为自身抗体的产生及自身免疫性疾病的发生提供了基础。SLE中已经发现一些导致凋亡物质清除不足的异常，如吞噬细胞清除不足、补体缺陷等。凋亡物质清除不足可导致凋亡物质在组织中堆积，大量被修饰或隐匿的自身抗原释放并激活树突状细胞(DCs)，激活的DCs提呈抗原给Th细胞，继而活化自身反应性B细胞，产生大量自身抗体，形成恶性循环。
　　 树突状细胞异常: DCs是体内最强大的专职抗原提呈细胞，能激活初始型T细胞活化，诱导机体免疫耐受，也能触发强烈的免疫反应，并参与调解免疫应答，在固有免疫和适应性免疫中都发挥着重要作用。大量的研究证实，DCs表面的Toll样受体(TLRs)、Fcγ受体(FcγRs)及其产生的Ⅰ型干扰素(IFN)均与SLE的发生和活动性密切相关。
　　 Th细胞异常:尽管细胞凋亡异常和树突状细胞在自身抗原的产生和提呈上发挥重要作用，但Th细胞及其产生的细胞因子所介导的炎症反应和免疫调节在SLE发病机制中可能发挥更为关键的作用。Th细胞通过提供协同刺激分子和细胞因子启动B细胞依赖自身抗原抗体反应，效应型Th细胞如Th1、Th2、Th17细胞过度活化还可直接引起各种炎症反应。另一方面机体免疫系统具有完整的免疫调节功能，而这种免疫调节作用的主导者是Th细胞，特别是Treg细胞，正常情况下抑制对自身反应的B细胞的激活，防止发生自身免疫。有效的免疫稳态依赖于Th细胞激活与Treg细胞抑制的平衡，当平衡被打破，免疫系统有利于激活时，机体则容易发生自身免疫疾病。
　　 根据其产生细胞因子及生物学功能的不同，Th细胞可分为Th1、Th2、Th17、Treg细胞。Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2，激活巨噬细胞杀伤胞内寄生的病原体，并介导迟发相超敏反应，促进炎症反应;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13，辅助体液免疫，在变态反应及抗寄生虫感染中发挥重要作用;在TGF-β、IL-6共同作用下分化为Th17细胞，分泌IL-17、参与自身免疫性疾病和炎症反应;在TGF-β单独作用下分化为Treg细胞，表达叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(Foxp3)，分泌TGF-β，参与诱导免疫耐受和免疫调节。Th1/Th2/Th17/Treg四类细胞，关键的转录因子及各自的效应分子的不同，决定了其在功能上的巨大差异。
　　 近年来，随着对Th17细胞和Treg细胞认识的深入，越来越多的证据表明Th17、Treg细胞在自身免疫性疾病如SLE中可能发挥更为关键的作用。研究结果证实，无论是SLE患者还是狼疮动物模型体内都存在着Th17、Treg细胞比例及决定其功能的特定细胞因子IL-17、转录因子Foxp3的失衡。
　　 Th17细胞产生大量的IL-17，具有诱导多种类型细胞产生炎性细胞因子和趋化因子，招募活化中性粒细胞等作用。IL-17还可诱导血管生成、启动和维持炎症反应。IL-17属于促炎因子，是Th17细胞发挥其功能的关键因子，与许多自身免疫疾病的发生、发展密切相关，在多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、炎症性肠病等疾病中IL-17的表达均增加。
　　 Treg细胞是一类具有免疫调节功能的T淋巴细胞，是维持免疫稳态、调控免疫应答的关键，在自身免疫性疾病、肿瘤、移植物抗宿主病等方面发挥重要作用。Foxp3是Treg细胞的特异转录因子，在Treg细胞分化发育功能上起重要作用，Foxp3表达和功能的异常将导致Treg细胞功能的缺失。Treg细胞能够抑制自身反应性T、B淋巴细胞的活化及相关细胞因子的分泌，诱导自身耐受，阻止自身免疫疾病、超敏反应、炎症等的发生和发展，Treg细胞功能缺陷或数量减少已证实与许多自身免疫疾病相关。
　　 在SLE中可能存在着促炎的Th17细胞和保护性的Treg细胞平衡失调，使Th17细胞过度活化，而抑制免疫反应、维持自身耐受的Treg细胞下调从而引起免疫反应。Th17、Treg细胞及其特异因子在SLE都存在着数量或功能的异常，而在其分化中受TGF-β和IL-6的共同调节，因此Th17、Treg细胞及其特异因子IL-17和Foxp3的平衡失调可能在SLE的发病机制中起关键作用。
　　 动物模型是研究人类疾病病因、发病机制、治疗方法的一种重要工具，狼疮小鼠模型被广泛用于研究SLE的发病机制和治疗。狼疮鼠模型可分为自发性和化学物质诱导的狼疮鼠模型两大类，其中MRL/lpr狼疮模型鼠是比较常见的自发性SLE动物模型之一。MRL/lpr小鼠与人类SLE类似，其特征是出现大量自身抗体和致命性的肾小球肾炎，发病较早，早在8周龄血清就可检测出自身抗体，12周龄淋巴结病变出现，在12-16周龄，MRL/lpr小鼠开始产生多种自身抗体包括抗双链DNA抗体，并有多个器官累及。从16到24周，免疫复合物沉积引起肾小球肾炎，血管炎、关节炎、和多淋巴结病，只有50％的老鼠存活到24周龄，其中肾脏功能异常大约开始于16周龄，主要表现为严重的蛋白尿。
　　 临床上常用于治疗SLE的药物和方法主要有糖皮质激素、免疫抑制剂，生物制剂、大剂量免疫球蛋白静脉注射、造血干细胞移植等。尽管几十年来SLE的治疗已经取得了很大的成就，SLE患者的存活率显著提高。但目前尚无特别理想的治疗药物和治疗方法，目前的治疗只能达到控制病情，而不能彻底治愈，且长期应用都会有比较大的副反应。中医药是我国传统医学的一大宝库，部分中药已证实在自身免疫性疾病中多环节、多途径的发挥其免疫调节作用，且副作用小，复发率低，在自身免疫性疾病特别是SLE中显示出独特的应用前景。
　　 白芍总苷(TGP)是植物芍药根中提取的一组糖苷类物质，芍药苷占90％以上，是其主要有效成分。临床应用和药理研究发现，TGP具有多途径抑制自身免疫反应、抗炎、止痛、免疫调节、抗氧化的功效和较小的副作用，在多种自身免疫性疾病中如RA、SLE、强直性脊柱炎中得到广泛应用。
　　 TGP在SLE的治疗中发挥重要作用，可以减轻炎症反应和缓解狼疮的病情，但关于其在系统性红斑狼疮中的作用机制仍不清楚，是否TGP通过调节Treg和Th17细胞比例失衡来发挥对SLE的保护作用，仍需要进一步的探讨。本研究拟通过实时荧光定量PCR检测TGP给药处理前后，狼疮小鼠外周血Th17、Treg细胞分泌的特异因子IL-17、Foxp3mRNA的表达情况，分析TGP治疗与Th17、Treg细胞失衡的相关性，以深入了解TGP在SLE的可能的作用机制，为TGP在临床上更好的应用提供依据。
　　 目的:观察TGP对MRL/lpr狼疮小鼠尿蛋白含量及外周血抗ds-DNA抗体水平、IL-17、Foxp3mRNA表达的影响。
　　 方法:将20只雌性狼疮小鼠按体重随机分成3组:TGP高剂量组、TGP低剂量组、对照组。按照《人与动物间体表面积折算的等效剂量比值表》及TGP商品药帕夫林常规剂量(1200～1800mg/60kg·d)计算，TGP高剂量组与TGP低剂量组小鼠每天分别灌胃给予TGP悬液121mg/kg、81mg/kg，对照组每天给予纯净水，每天1次，连续4周。给药前、给药2周、4周，用代谢笼收集动物24h尿液，考马斯亮蓝法集中检测尿蛋白含量;采血0.2-0.3ml，离心取血清，ELISA法检测外周血抗ds-DNA抗体水平。4周后处死各组小鼠，收集外周血，实时荧光定量PCR检测外周血IL-17、Foxp3mRNA表达水平。
　　 结果:
　　 1.一般情况：用药前各组小鼠在实验期间摄食正常，毛发正常，活动自如;随着时间的推移，对照组小鼠逐渐出现精神倦怠、喜蜷卧，摄食、活动次数减少，毛发光泽度下降。TGP低浓度组与高浓度组摄食活动及活动次数、灵敏度较发病前无明显改变，无明显毛发脱落，仅毛发光泽度较前有所下降。实验过程中各组小鼠口、眼、耳、鼻均未见异常分泌物;大便无稀烂，尿量未见异常，尿液澄清透明;实验结束时两组均无死亡。
　　 2.小鼠尿蛋白含量的变化：用药前及用药后2周，3组小鼠尿蛋白含量比较差异无统计学意义;用药后4周，与对照组相比，高剂量组、低剂量组小鼠尿蛋白含量降低，差异有统计学意义，与低剂量组相比，高剂量组小鼠尿蛋白含量降低，差异有统计学意义。
　　 3.小鼠抗ds-DNA抗体水平的变化：用药前、用药后2周，3组小鼠抗ds-DNA抗体水平比较差异无统计学意义;用药后4周，与对照组相比，高剂量组、低剂量组小鼠小鼠抗ds-DNA抗体升高，差异有统计学意义，低剂量组与高剂量组小鼠抗ds-DNA抗体水平比较差异无统计学意义。
　　 4.外周血IL-17、Foxp3mRNA表达：用药后4周，对照组、低剂量组、高剂量组小鼠外周血Foxp3mRNA表达比较差异无统计学意义;与对照组相比，低剂量组和高剂量组小鼠，外周血IL-17mRNA表达降低，与低剂量组比较，高剂量组外周血IL-17mRNA表达降低。
　　 结论:TGP可降低SLE小鼠尿蛋白含量，具有延缓病情进展，保护肾脏的作用，但升高外周血抗ds-DNA抗体水平，并可能通过下调IL-17，调节狼疮小鼠Th17/Treg平衡这一机制发挥治疗作用。

目录

摘要

第一章 前言

细胞凋亡异常

树突状细胞异常

Th细胞异常

第二章 TGP对MRL／lpr小鼠IL-17、Foxp3 mRNA表达的影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4讨论

小结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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