抗小鼠TLR2胞外段单表达位抗体TSP-2对非特异性炎症的影响

摘要

过敏性哮喘是一种比较顽固的疾病,本质是由多种炎症细胞和一系列细胞因子参与的一种慢性气道炎症,症状是由于支气管平滑肌痉挛而引起的哮喘和呼吸困难,最显著的特点是免疫异常。慢性气道炎症、气道重塑和气道高反应性是过敏性哮喘的特征。哺乳动物Toll样受体是果蝇Toil的同系物,它们构成了一个新的蛋白质家族,参与天然免疫的介导和获得性免疫的激活。Toll样受体2(TLR2)作为脊椎动物蛋白TLR家族的一员,在过敏性哮喘的发展过程中发挥了重要的作用。树突状细胞(DC)是强有力的抗原提呈细胞(APC),是机体免疫反应的始动者,可通过多种途径参与过敏性哮喘发病,它能激活初始T细胞(naive Tcells),调节Th1/Th2反应,参与免疫应答。DC作为主要的APC,细胞表面有多种TLRs表达,其中包括TLR2,DC是公认的连接天然免疫与调节性免疫的桥梁,未成熟的DC不具备抗原递呈功能,DC成熟的标志性特征是能分泌产生IL-12和TNF-α。研究发现包括TLR2配体在内的很多信号能与未成熟的DC结合,促使它成熟活化,但这些信号的作用机制仍不清楚。成熟活化的。DC(多数为类浆DC)能促使初始T细胞(T0细胞)的极化分化,正常情况下DC初步活化时能产生低剂量的IL-12,促使T0细胞向Th2型细胞分化,然而当成熟的DC持续活化产生大量的IL-12和TNF-α时,就会抑制Th2型免疫反应,驱动T0细胞向Th1型细胞分化,产生IFN-γ,完成由天然免疫向调节性免疫的过渡。有研究报道,TLR2活化能诱导DC分泌IL-10,其机制是依赖MEK激酶ERK信号通路,并发现TLR2的配体zymosan无论在体内或体外均能诱导DC分泌大量的IL-10。也有实验报道体外培养的骨髓来源DC和单核细胞能被TLR2配体激发产生钙的外流,且信号能在邻近细胞中传播约100μm。在鼠的过敏性哮喘模型实验研究中,发现DC能捕获并递呈抗原导致T细胞的耐受。与此呼应的是,最近有实验发现,在OVA诱导的小鼠过敏性哮喘模型中,DC细胞TLR2的表达和宿主防御因子IL-6的产生被抑制,造成肺部的持续炎症感染和气道重建,这种现象在用大剂量的Th2型细胞因子IL-4和IL-13刺激体外培养的肺部未成熟DC和骨髓来源DC实验中得到验证。
　　 小鼠和人的TLR2都是果蝇TLR2的同源蛋白,两者在氨基酸水平上有83％的同源性,在分布和生物学活性方面有诸多相似,而且小鼠树突状细胞能够表达TLR2,因此小鼠是研究TLR2结构、功能及其抗体的作用的良好模型。已有的研究表明抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2具有多种生物学活性:抗炎,抗过敏性休克,调节免疫等作用。本研究对抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2在体内对小鼠过敏性哮喘和脓毒症以及在体外对小鼠树突状细胞系DC2.4的成熟活化的作用进行了初步研究。观察了抗体TSP-2对OVA诱导的小鼠过敏性哮喘和CLP诱导的小鼠脓毒症中炎性细胞渗出和细胞因子等变化的影响。
　　 本研究的主要结果和结论:
　　 一.抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对小鼠过敏性哮喘的影响在本研究中,我们根据以前的研究结果,通过公司制备了纯化的mTLR2胞外段单表位抗体TSP-2。
　　 为了观察在体外抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对小鼠树突状细胞系DC2.4的成熟活化的影响。首先通过免疫组织化学法证实小鼠DC2.4细胞的细胞膜上的TLR2能够与抗体TSP-2结合,利用共聚焦显微镜观察发现抗体TSP-2能够促进DC2.4细胞表达TLR2。为了观察在体内抗体TSP-2对OVA诱导的小鼠过敏性哮喘的作用,首先把6-8周龄Balb/c小鼠随机分成6组,即正常对照组,模型组,抗体TSP-2治疗组,抗体TSP-2预防组,正常兔IgG治疗组和预防组。除正常对照组,其它各组小鼠分别于第0、14日以OVA联合Al(OH)3凝胶混合液腹腔注射致敏,第21天始每天给予雾化1％OVA溶液作激发,每次30分钟,连续3天。正常对照组,模型组,抗体TSP-2治疗组、正常兔IgG治疗组在每次激发后2小时分别注射PBS、抗体TSP-2以及正常兔IgG,抗体TSP-2预防组和正常兔IgG预防组每次激发前2小时分别尾静脉注射抗体TSP-2以及正常兔IgG。通过体积描记仪检测气道高反应性,病理切片观察炎症浸润,ELISA检测肺泡灌洗液中的细胞因子INF-γ、IL-4、IL—12和IL-13。实验结果表明抗体TSP-2能降低过敏性哮喘Balb/c小鼠气道对乙酰甲胆碱的反应性,明显降低支气管肺泡灌洗液细胞因子IL-4和IL-13的表达量,提高细胞因子INF-γ和IL-12的表达量,减轻过敏性哮喘小鼠肺组织的炎症反应,改善支气管结构的完整性。
　　 二.抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2对小鼠脓毒症影响的初步研究已知在脓毒症的病理生理过程中,免疫功能紊乱是造成脓毒症治疗困难和高致死率的重要原因。胃肠道是主要的受累器官,树突状细胞作为免疫系统重要组成部分,在肠道广泛分布于肠粘膜固有层,通过多种途径摄取肠腔内的抗原,在防御病体侵袭的同时又避免病理性炎症产生。树突状细胞可以表达TR2,因此抗小鼠TLR2胞外段单表位抗体TSP-2可能对脓毒症小鼠起到一定的作用。
　　 本部分实验参照Daniel Rittirsch报道的CLP法复制小鼠脓毒症模型:动物术前12h禁食,自由饮水。小鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后,固定、备皮、常规消毒、铺无菌洞巾,沿腹正中线作-1.5～2cm长的切口,找到盲肠,小心分离,用7号丝线在其中部结扎,22号针穿通盲肠远端1/4肠壁,轻挤出少量肠内容物(约1mm),留置2mm皮瓣防止针孔闭合,还纳盲肠于腹腔,逐层缝合腹壁切口,术毕皮下注射生理盐水(30ml/kg)抗休克。120只小鼠随机分成4组,每组30只:假手术+生理盐水组(10ml/kg)；CLP+生理盐水组(10ml/kg)；CLP+兔IgG组(2.5mg/kg)；CLP+TSP-2组(2.5mg/kg)。假手术组仅开腹翻动盲肠关腹,其余处理方法相同。根据分组情况,术后立即分别尾静脉注射生理盐水、正常兔IgG或抗体TSP-2。术后6、12、24h,小鼠处死,收集小肠组织(回肠)。实验结果发现模型组NF—κB表达水平较假手术组显著上升；TSP-2治疗组NF-κB表达水平较模型组显著下调；模型组各时间点。TNF-α和IL-6水平均高于假手术组(P<0.05)；TSP-2治疗组与模型组相比,TNF-α和IL-6水平明显降低(P<0.05),TNF-α和IL-6 mRNA水平也低于模型组(P<0.05)。正常兔IgG治疗组与模型组比较,结果无统计学意义(P>0.05)。这表明抗体TSP-2能抑制脓毒症小鼠肠道NF-κB的活化,并下调致炎细胞因子TNF-α和IL-6水平,对脓毒血症引起的肠道炎症起到一定的控制作用,并延缓脓毒血症的病情发展,但是其作用的具体机制仍在研究中。