抗小鼠TLR2抗体TSP-2抑制小鼠肥大细胞脱颗粒作用的初步研究

摘要

哺乳动物Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)是果蝇Toll的同系物，它们构成一个新的蛋白家庭家族，是一类与天然免疫关系密切的模式识别受体，参与天然免疫的介导并激活获得性免疫。其共同特点是胞外段有富含亮氨酸的重复结构域(LRR)，胞内段与IL-1受体具同源性；其信号转导主要经IL-1R相关激酶(IRAK)，导致NF-κB激活，继而产生细胞因子。自1997年发现第一个哺乳动物TLRs以来，迄今为止已发现TLRs分子约12个，即Toll1-11和18-wheeler。研究表明，TLRs不仅参与天然免疫与感染免疫，还可参与非感染免疫及获得性免疫，如抗原递呈、诱导免疫耐受、细胞凋亡，并以此在自身免疫病、超敏反应、移植排斥及肿瘤免疫中发挥重要作用。而某些TLRs能诱导抑制或增强炎症反应的相关细胞因子如IL-10，IL-4，IL-5和IL-13的产生，这些细胞因子在炎症导致的病理损伤和机体防御中均起重要作用。目前认为过敏性疾病与Th2型T细胞产生的细胞因子密切相关，如Th2型细胞因子IL-4能诱导IgE的产生，IL-5可趋化嗜酸性粒细胞聚集；而与感染有关的Th1型细胞因子如IL-12、IFN-γ等则能抑制Th2型细胞因子的作用，从而抑制过敏反应的炎症反应。正如有人提出的卫生学假说，幼儿及青少年时期发生感染机会减少则过敏症的发病率相应升高。哺乳动物的很多TLRs都参与了过敏性炎症过程，其中以TLR2、TLR4和TLR9研究较多；已知TLR2是人类TLRs家族成员中表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多的分子，被认为是所有TLRs中具中心作用的或中枢型识别(centralpatternrecognition)受体。TLR2分子主要表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、γ/δT、Th1、Th2α/βT，尤其在脾脏和外周血白细胞高表达，其次在部分消化道上皮细胞株、B细胞株及大鼠心肌细胞、脑组织、齿龈细胞等也有表达。尽管有许多实验证实了TLR2与一些配基相互作用参与了免疫相关事件，但是关于TLR2抗体的作用研究报道很少。另外，有很多研究表明肥大细胞膜上的TLR2在介导肥大细胞活化中发挥重要作用。 小鼠TLR2(mTLR2)和人TLR2(hTLR2)氨基酸水平上有83％的同源性，在分布、生物学活性方面的诸多相似，且小鼠肥大细胞可表达TLR2和TLR4，而人的肥大细胞仅表达TLR2，因此研究TLR-2就更为具实际意义，而小鼠无疑是研究TLR2以及它与相应配基及抗体相互作用、作用的效应等的良好模型。本课题组已有的研究工作发现，在对OVA致敏的小鼠进行攻击前，静脉注射抗小鼠TLR2胞外段(mouseTLR2extracellulardomain，mTLR-2ECD)单表位抗体TSP-2能有效地抑制OVA引发的过敏性休克，有关机制正在研究中。国内外已有的研究结果表明TLR2与其某些配基如PGN、Pam3CSK4等的相互作用参与了过敏性哮喘炎症过程，本研究对抗小鼠TLR2抗体TSP-2在体内对小鼠过敏性哮喘和腹膜炎以及在体外对小鼠肥大细胞瘤细胞P815细胞中的作用进行了初步研究。观察了TSP-2在OVA诱导的小鼠支气管哮喘和酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎中炎性细胞渗出和炎性介质如组胺、白三烯等变化的影响；并观察了抗mTLR2胞外段抗体TSP-2对非过敏原诱导的肥大细胞脱颗粒的作用。 本研究的主要结果和结论如下： 一、抗mTLR2ECDTSP-2抑制c48/80诱导小鼠肥大细胞脱颗粒的作用在本研究中，我们用mTLR2不同表位的合成肽和融合蛋白作为抗原免疫家兔并纯化获得了两种抗mTLR-2胞外段抗体TSP-2和TSP-3。从理论上分析，由于TSP-3设计的是针对mTLR-2胞外段13-165氨基酸区域6个B识别表位，属于典型的多克隆抗体，而TSP-2仅针对1个B识别表位，且与TSP-3不在同一区域，再经过免疫亲和层析纯化后，获得的这种抗体虽为多克隆，却为单表位特异性。从结合活性方面几乎类似于单克隆抗体。且ELISA检测的抗体结合效价结果也说明抗体TSP-2比TSP-3更为敏感，这为我们进行mTLR-2相关功能的研究提供了极大的便利。 已知合成化合物C48/80(Compound48/80Phenethylamine，p-methoxy-N-methyl)可直接诱发的肥大细胞脱颗粒，其机制为激活G蛋白并引起SyK活化。为了观察在体外抗小鼠TLR-2胞外段单表位抗体(TSP-2)对C48/80诱导的P815肥大瘤细胞脱颗粒的影响。首先利用RT-PCR、免疫组化以及免疫荧光方法证实了小鼠肥大细胞瘤P815细胞在mRNA水平的表达，及细胞膜表面的TLR-2与抗体TSP-2的结合，并利用组化染色与激光共聚焦显微镜观察了抗mTLR2ECD单表位抗体TSP-2对C48/80诱导的P815肥大瘤细胞脱颗粒反应所致的形态学改变与钙流出的影响。结果显示P815细胞在mRNA水平以及膜表面均有TLR2表达，抗体TSP-2能有效抑制C48/80诱导的P815肥大瘤细胞脱颗粒反应所致的形态学改变与钙流出。上述结果表明抗体TLR2可抑制非过敏原物质C48/80诱发的肥大细胞脱颗粒。 二、抗mTLR-2ECD抗体TSP-2抑制酵母多糖诱发小鼠腹膜炎的研究 已知酵母多糖诱发的小鼠急性腹膜炎中腹腔灌洗液的炎性细胞渗出显著增多，其中主要是单核细胞和肥大细胞[41]，即利用酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎病理变化主要由肥大细胞介导。在此基础上，本部分工作研究了抗mTLR-2ECD单表位抗体TSP-2在酵母多糖诱导的腹膜炎模型中的主要作用，以正常未处理小鼠为对照，设立PBS组、正常兔IgG、抗体TSP-2组和抗体TSP-3组，各组在腹腔注射(i.p.)酵母多糖诱导模型前，静脉注射(i.v.)PBS、正常兔IgG、抗体TSP-2和抗体TSP-3，最后收集腹腔灌洗液，并观察了抗体TSP-2对模型动物的扭身次数、腹腔灌沈液的伊文思兰渗出、腹腔白细胞浸润的数量变化、腹腔肥大细胞脱颗粒情况以及腹腔灌洗液离心上清中PAF和TNFa水平的影响。实验结果显示，与PBS处理组、抗体TSP-3以及正常兔IgG组相比，抗体TSP-2能抑制小鼠因腹腔炎症引起的扭身次数、腹腔灌洗液中伊文思蓝OD值降低、腹腔灌洗液中白细胞渗透和C48/80诱导的腹腔肥大细胞脱颗粒。提示抗体TSP-2可能通过对肥大细胞脱颗粒的抑制作用减轻酵母多糖诱导的小鼠的腹膜炎炎症。 三、抗mTLR-2ECD抗体TSP-2对小鼠过敏性哮喘气道炎症的影响 已知在小鼠实验性过敏性哮喘模型中，某些TLR2的配基如PGN,Pam3CSK4能介导肥大细胞活化脱颗粒从而加剧过敏性哮喘的炎症反应，这说明TLR2通过与其配基的相互作用介导肥大细胞活化进而参与了过敏性哮喘，但尚未见关于TLR2与其抗体作用参与过敏性反应的相关研究报道。 本部分实验利用OVA诱导的小鼠哮喘模型，观察了抗体TSP-2对小鼠过敏性哮喘模型气道炎症的影响。模型动物采用纯系BALB/c小鼠，根据激发哮喘前尾静脉注射的液体不同分为TSP-2组、正常兔IgG组、PBS组和正常未致敏组，各组分别在0和14天用100μg的OVA福氏完全佐剂混合后腹腔免疫小鼠，并在第14天，鼻内麻醉小鼠，补加免疫1次，即用100μgOVA40μl给小鼠滴鼻；各组分别在第25、26和27天利用OVA激发诱导过敏性哮喘，各组用含10μgOVA的PBS40μl滴鼻，正常对照组用等量PBS滴鼻；除正常对照组外，各组在每次OVA激发前6h根据分组分别进行尾静脉注射兔IgG(3mg/kg)、抗体TSP-2(3mg/kg)和PBS。实验结果发现静脉给予抗体TSP-2能有效的抑制气道炎症和炎症细胞的浸润。与正常兔IgG相比，抗体TSP-2的抑制作用主要表现在以下几个方面：肺泡灌洗液中的白细胞浸润减少；减轻攻击后血清中游离OVA特异性IgE抗体浓度的降低；肺脏常规切片观察结果也表明抗体TSP-2能抑制OVA诱导的小鼠过敏性哮喘模型肺脏中肺泡毛细血管充血水肿等病理变化；但肺泡灌洗液和肺脏常规切片中少见过敏反应特征性细胞嗜酸性细胞的渗出和浸润。上述实验结果说明了抗体TSP-2对过敏性哮喘的病理变化有一定的抑制作用，其有关机制的研究仍在进行中。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章抗mTLR-2ECD单表位抗体对C48/80诱导肥大细胞脱颗粒的影响

第二章抗mTLR-2ECD单表位抗体TSP-2抑制酵母多糖诱发小鼠腹膜炎的作用

第三章抗mTLR-2ECD单表位抗体TSP-2对小鼠过敏性哮喘气道炎症的影响

全文总结

参考文献

附录

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