Disulfiram联合Cu通过调节ROS-JNK,NF-κB以及Nrf2通路诱导淋巴系肿瘤细胞凋亡

摘要

背景:急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)是血液系统恶性肿瘤中较为常见的疾病,其中T-ALL由于其易对髓外组织和器官的浸润,缓解后极易复发,治疗还比较困难；而Burkitt’s淋巴瘤是一种侵袭性B细胞NHL,疾病进展快,常规化疗的效果不佳。随着现代治疗方法的改进以及支持治疗的加强,大剂量多药联合化疗提高了高危淋巴系肿瘤的完全缓解率(CR),但远期疗效并不令人满意,复发是治疗失败的主要原因,一旦复发,再次缓解率低,预后差。难治复发仍然是高危淋巴系肿瘤治疗的主要障碍和亟待解决的难题,而耐药是导致难治复发的重要因素。此外,大剂量多药联合化疗的毒副作用导致严重并发症也是影响高危淋巴系肿瘤疗效进一步提高的主要障碍之一,不少患者死于化疗的并发症而不是肿瘤的进展。由于化疗导致的系统性毒性和药物耐药是高危淋巴系肿瘤治疗失败的主要障碍,而新的分子靶向药物也存在价格昂贵等问题,从传统价廉、且毒副作用小的药物中开发具有抗肿瘤活性的cc新用途”越来越引起重视。
　　 Disulfiram(DSF)是临床应用超过60年的抗酗酒药物,安全性好,价格低廉。研究发现DSF单药可以诱导一系列实体瘤细胞的凋亡及抑制其增殖,但是关于其对白血病细胞的作用尚存争议。作为二价金属离子螯合剂,DSF能够强烈螯合Cu离子形成DSF/Cu复合物,体外实验发现Cu可显著提高DSF诱导实体瘤细胞凋亡的作用。以往研究发现DSF诱导肿瘤细胞凋亡的主要机制是抑制NF-κB的表达,但关于DSF/Cu诱导实体瘤细胞凋亡的分子机制尚不明确。是否还有其他机制参与DSF/Cu诱导实体瘤细胞凋亡仍需要进一步探索。
　　 药物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时也触发了抗凋亡因子的产生,这是导致肿瘤细胞耐药的重要机制。而NF-κB则是最主要的抗凋亡因子之一。NF-κB是包含p50和p65在内的一种异二聚体。其中p65所占比例较多,且调控下游一系列抗凋亡基因的表达,因此,p65被认为是调控NF-κB活性的关键成分。抑制p65的活性可以诱导肿瘤细胞的凋亡,并且可以减少NF-κB调控的抗凋亡因子的表达。而p65的过度表达可以诱导NF-κB持续活化引起细胞耐药。
　　 ROS的产生是细胞呼吸作用的结果,在许多细胞生物学特性中,ROS的产生与一些病理过程有关。ROS可以诱导包括蛋白、磷脂以及DNA在内的细胞结构的破坏。研究表明肿瘤细胞ROS水平略高于正常细胞,但由于有效的抗氧化机制的存在,肿瘤细胞对相对高水平的ROS是可以耐受。但当各种因素导致肿瘤细胞的ROS水平超过其可耐受阈值则会导致肿瘤细胞的凋亡,同时高水平的ROS可破坏具有抗氧化作用的转录因子Nrf2活性,因而进一步增强ROS介导的细胞凋亡。此外,ROS与JNK通路在诱导肿瘤细胞凋亡过程中可能存在相互促进作用。
　　 近几十年来,Disulfiram(DSF)由于可以抑制醛脱氢酶而一直用于抗酗酒治疗,副作用很小。而最近的研究则关注到DSF抗肿瘤的作用,已有不少的研究报道DSF联合Cu可以诱导包括胶质瘤、肺癌、黑色素瘤细胞在内的许多实体瘤细胞的凋亡。而关于DSF/Cu对淋巴系肿瘤细胞作用的研究报道较少。本课题旨在探讨DSF/Cu能否有效杀伤人淋巴系肿瘤Molt4和Raji细胞株以及与ROS、JNK、Nrf2以及NF-κB通路的关系以及各通路之间的相互联系。
　　 研究目的:本课题以人急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt4以及B细胞淋巴瘤(Burkitt’s)细胞株Raji为研究对象,探讨DSF/Cu能否在体外诱导Molt4和Raji细胞的凋亡,并进一步从ROS、JNK、Nrf2以及NF—κB通路探讨其潜在的分子机制。
　　 研究方法
　　 1.细胞株:人急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt4及人B细胞淋巴瘤(Burkjtt,s)细胞株Raji。
　　 2.MTT法评价浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和上述浓度DSF联合Cu离子(1μM)处理24小时对上述不同肿瘤细胞的体外抑制增殖的作用和明确DSF和DSF/Cu对上述肿瘤细胞的IC50。
　　 3.
　　 1)Annexin V/PI双染色流式细胞术检测0.125、0.25、0.5、1、2μ m/ml的DSF和上述浓度DSF联合Cu离子(1μM)处理Molt4细胞株24小时后凋亡细胞比例；
　　 2)Annexin V/PI双染色流式细胞术检测0.5、1、2.5、5、7.5μ m/ml的DSF和上述浓度DSF联合Cu离子(1μM)处理Raji细胞24小时后凋亡细胞比例；
　　 4.Hoechst33342染色法观察不同浓度DSF和DSF/Cu处理两种肿瘤细胞后的形态变化；
　　 5.流式细胞仪检测浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和上述浓度DSF联合Cu离子(1μM)处理Molt4细胞株8小时候细胞内ROS水平:
　　 6.应用实时荧光定量PCR法分别检测浓度为0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和DSF联合Cu离子(1μM)以及DSF/Cu/NAC处理Molt4细胞株24小时后Nrf2基因的表达,采用2-Δct法对PCR结果进行计算,分析Nrf2的表达量与各种不同处理组的关系。
　　 7.Western Blotting检测0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和上述浓度DSF联合Cu离子(1μM)处理Molt4细胞株24小时以及Cu组(1μM)、DSF组(DSF:IC50-DSF/Cu)、DSF/Cu组(DSF:IC50-DSF/Cu,Cu:1μm)；DSF/Cu/NAC组(DSF:IC50-DSF/Cu,Cu:1μm,NAC:10mM)五组作用24小时后Molt4细胞Bcl-2、JNK,磷酸化JNK(p-JNK)、Nrf2和p65蛋白表达变化。
　　 8.采用SPSS13.0软件进行统计学分析,两组间均数的比较使用独立样本t检验方法；配对剂量资料的比较采用配对样本t检验；多组间均数比较使用单因素方差分析方法进行统计,在方差分析显著的情况下使用Bonferroni(方差齐性)进行多重比较；若方差不齐则采用近似F检验(如Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett T3方法进行多重比较；计量资料用x±s表示,检验水准为α=0.05,双侧检验。
　　 结果
　　 1.DSF单药及DSF/Cu对两种细胞株在体外均有明显抑制增殖作用。MTT结果显示:DSF单药对Molt4和Raji细胞24小时的IC50值分别为:(IC50-Molt4-DsF=1.314±0.229μM/ml)、(IC50-Raji-DSF=5.064±2.268μM/ml)；DSF/Cu对Molt4和Raji细胞的IC50值分别为:(IC50-M0lt4-DSF/Cu=0.435±0.109μM/ml),(IC50-Raji-DSF/Cu=0.891±0.093μM/ml)。DSF/Cu对Molt4和Raji细胞的IC50显著低于DSF单药,差异有统计学意义(t=-5.993、P--0.004和t=0.610、P=0.033),提示Cu可显著增强DSF对Molt4和Raji细胞的增殖抑制作用。
　　 2.DSF单药及DSF/Cu对Molt4和Raji细胞具有诱导凋亡作用。
　　 [1]Hoechst33342染色观察细胞凋亡的形态学改变:显微镜观察不同浓度DSF和DSF/Cu对Molt4和aaji细胞处理24小时后,通过Hoechst33342染色观察细胞凋亡的形态学改变,结果发现,Molt4细胞株经低浓度的DSF(0.125、0.25、0.5μM)处理后细胞凋亡特征不明显,而当DSF浓度提高为(1、2μM)时,细胞出现核固缩、凝集,并有凋亡小体,变现为明亮的颗粒状蓝染:而DSF/Cu组在低浓度组(0.125μM)就可见较典型的凋亡现象,但当浓度提高为0.25μM后,凋亡现象更加明显,且随DSF/Cu浓度增加而增多。Raji细胞经DSF和DSF/Cu处理后同样出现与Molt4细胞相似的形态学变化。
　　 [2]Annexin V/PI染色流式细胞术检测凋亡细胞比例:根据MTT和预实验结果,选取0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和DSF联合Cu离子(1μM)处理Molt4细胞株24小时后观察细胞凋亡比例变化。结果显示,DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4浓度主效应差异存在统计学意义(F=423.317,P=0.000)；DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4细胞处理方法主效应差异也存在统计学意义(F=84.305,P=0.000)。提示随着DSF或者DSF/Cu浓度增加,Molt4细胞的凋亡细胞比例逐渐升高,凋亡比例表现剂量依赖性。进一步应用方差分析比较两种不同处理组细胞凋亡率的差异。对照组DSF、DSF/Cu的自然凋亡率分别为4.016％=1=0.930％、3.977％±0.609％。经单因素方差分析,不同浓度的DSF或者DSF/Cu均可诱导Molt4细胞凋亡,与对照组相比均有显著性差异(F=98.573、P=0.000:F=199.891、P=0.000)应用两独立样本T检验发现,同一浓度的DSF和DSF/Cu作用于Molt4细胞,其凋亡细胞比例存在统计学差异(t=-8.338,P=0.001；t=4.957,P=0.008；t=-24.034,P=0.001:t=-14.614,P=0.001；t=-14.52,P=0.000)。提示同一浓度的DSF/Cu比DSF更能有效诱导Molt4细胞凋亡。
　　 同样,我们选取0.5、1、2.5、5、7.5μm/ml的DSF和DSF联合Cu离子(1μM)处理Raji细胞24小时后观察凋亡细胞比例；结果显示,DSF和DSF/Cu分别作用于Raji细胞浓度主效应差异存在统计学意义(F=356.370,P=0.000):DSF和DSF/Cu分别作用于Raji细胞处理方法主效应差异也存在统计学意义(F=419.434,P=0.000)。提示随着DSF或者DSF/Cu浓度增加,Raji细胞的凋亡细胞比例逐渐升高,凋亡比例表现剂量依赖性。应用两独立样本T检验检测同一浓度下,DSF和DSF/Cu处理Raji细胞后诱导细胞凋亡比例是否存在差异。结果显示DSF和DSF/Cu各浓度诱导细胞凋亡比例相比,均存在统计学差异(t=-12.277,P=0.000:t=-10.748,P=0.000；t=-9.014,P=0.001:t=-8.334,P=0.001:t=-11.321,P=0.000)。根据统计结果,我们认为DSF和DSF/Cu对Raji细胞均存在诱导凋亡的能力,但DSF/Cu诱导细胞凋亡的作用明显强于DSF。
　　 [3]Western blotting检测抗凋亡蛋白表达:我们选择不同浓度的DSF(0.125、0.25、0.5、1、2μM/ml)和以上浓度DSF联合Cu1μM作用于Molt4细胞24小时后,以Western Blotting方法检测抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达情况。结果显示:DSF/Cu组Molt4细胞内Bcl-2蛋白表达较空白对照组受抑,且呈剂量依赖性。而DSF单药组仅在很高浓度是才能下调Bel-2蛋白表达。
　　 3.DSF/Cu可提高肿瘤细胞内的ROS水平:我们选取0、0.125、0.25、0.5、1、2μm/ml的DSF和DSF联合Cu离子(1μM)处理Molt4细胞8小时后观察凋亡细胞内ROS水平变化；结果显示,DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4细胞浓度主效应差异存在统计学意义(F=123.070,P=0.000)；随着DSF或者DSF/Cu浓度增加,Molt4细胞的ROS水平比例逐渐升高,DSF/Cu组升高更加明显,ROS水平比例表现剂量依赖性。应用两独立样本T检验检测同一浓度下,DSF和DSF/Cu处理Molt4细胞后诱导细胞内ROS蓄积是否存在差异。结果显示DSF和DSF/Cu各浓度诱导细胞凋亡比例相比,均存在统计学差异(t=-8.338,P=0.001；t=-4.957,P=0.008:t=-24.034,P=0.001；t=-14.614,P=0.001:t=-14.529,P=0.000)。根据统计结果,我们认为DSF和DSF/Cu对Molt4细胞均存在诱导细胞内ROS蓄积的能力,但DSF/Cu诱导诱导细胞内ROS蓄积的能力的作用明显强于DSF。
　　 4.DSF/Cu可下调肿瘤细胞内Nrf2的表达水平:将不同浓度的DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4细胞24小时后,以实时荧光定量PCR方法检测细胞内Nrf2的表达水平。结果显示,DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4浓度主效应差异存在统计学意义(F=34.909,P=0.000)；DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4细胞处理方法主效应差异也存在统计学意义(F=159.371,P=0.000)。随着DSF/Cu浓度增加,Molt4细胞的Nrf2表达水平逐渐降低,呈剂量依赖性。进一步分析比较两种不同处理组细胞Nrf2表达水平的差异,应用两独立样本T检验检测同一浓度下,DSF和DSF/Cu处理Molt4细胞后Nrf2水平变化是否存在统计学差异。结果显示DSF和DSF/Cu各浓度诱导细胞内Nrf2水平变化相比较,均存在统计学差异0=3.263,P=0.031；t=11.668,P=0.000；t=11.563,P=0.000；t=10.612,P=0.000；t=13.142,P=0.000)。结果表明DSF、DSF/Cu均可抑制细胞内Nrt2的表达,而DSF/Cu组对Nrf2的抑制效果更加明显。
　　 5.DSF/Cu可上调JNK通路表达,下调p65和Nrf2通路表达:将不同浓度的DSF和DSF/Cu分别作用于Molt4细胞24小时后,Western blotting结果显示两处理组总JNK蛋白表达均无明显变化,DSF/Cu组磷酸化JNK(p-JNK)表达随DSF/Cu浓度增加而明显上调,而DSF单药组p-JNK表达没有明显变化。同样以Western blotting方法检测p65蛋白变化,结果显示DSF单药和DSF/Cu组随药物浓度增高,p65表达逐渐下调,但DSF/Cu组p65表达下调程度显著高于DSF单药组。Western blotting方法检测Nrf2蛋白表达显示DSF组低浓度似乎可下调Nrf2表达,但随浓度增加这种作用反而不明显,而DSF/Cu组随药物浓度增加,Nrf2表达逐渐下调。
　　 6.ROS抑制剂-NAC对DSF/Cu诱导Molt4细胞凋亡的影响:应用流式细胞术观察各浓度DSF/Cu及加入ROS抑制剂NAC后作用Molt4细胞24小时后细胞凋亡比例的变化。加入NAC后DSF/Cu诱导Molt4细胞的凋亡细胞比例均出现不同程度下降,应用两独立样本T检验显示同一浓度下DSF/Cu和DSF/Cu/NAC两种处理后凋亡细胞比例均存在统计学差异(t=-1.719,P=0.161:t=5.090,P=0.007；t=-4.941,P=0.008；t=4.814,P=0.009；t=4.870,P=0.008),DSF/Cu组凋亡细胞比例明显高于DSF/Cu/NAC组。提示DSF/Cu诱导Molt4细胞的凋亡细胞比例可以被NAC所抑制。
　　 7.ROS是DSF/Cu调控JNK、p65以及Nrf2表达的关键:将不同浓度DSF/Cu以及DSF/Cu/NAC处理Molt4细胞24小时后,应用荧光定量PCR的方法检测细胞内Nrf2的表达水平。结果示加入NAC后DSF/Cu诱导Molt4细胞后Nrf2的表达水平均出现不同程度上升,应用两独立样本T检验检测同一浓度下,DSF/Cu与DSF/Cu/NAC两种方法处理细胞24小时后观察细胞内Nrf2的表达水平差异。统计结果显示在低浓度组(0.125μM)两种处理的Nrf2水平无差异,但从0.25μM起,DSF/Cu和DSF/Cu/NAC处理细胞后Nrf2的水平均存在统计学差异,DSF/Cu组的表达水平明显低于DSF/Cu/NAC组(t=-2.622,P=0.059；t=-3.473,P=0.026；t=-4.651,P=0.010；t=-5.245,P=0.006:t=-8.693,P=0.001)。提示NAC可抑制DSF/Cu对Nrf2的表达水平的下调能力。
　　 选择Cu(1μM)、DSF(0.5μM)、DSF/Cu(DSF:0.5μM,Cu:1μM)以及DSF/Cu/NAC(DSF:0.5μM,Cu:1μM,NAC:10mM)作用于Molt4细胞24小时后,应用Western Blotting的方法,观察细胞内通路的变化。结果提示:Cu组、DSF组与空白对照组相比,p-JNK蛋白表达无明显变化,DSF/Cu组p-JNK蛋白表达明显增高,但可以被NAC所抑制。Cu组同空白对照组的p65表达无明显变化,DSF组同DSF/Cu组的p65表达均较空白对照组明显下调,而DSF/Cu组p65表达下调更明显,DSF/Cu对p65表达下调作用也可以被NAC抑制。同样DSF/Cu组对Nrf2蛋白表达的下调作用也可被NAC所抑制。上述结果提示DSF/Cu很可能通过ROS调控着JNK、p65和Nrf2的表达。
　　 结论
　　 1.DSF单药对淋巴系肿瘤细胞具有一定的抑制增殖及诱导凋亡的作用；但Cu可显著提高其抑制增殖和诱导凋亡的作用。
　　 2.DSF单药及DSF/Cu均可显著提高Molt4细胞内ROS的水平,但DSF/Cu作用更加显著。
　　 3.DSF/Cu能够增加Molt4细胞内磷酸化JNK(p—JNK)的表达水平,下调p65和Nrf2的表达,且呈剂量依赖性。DSF单药下调p65的水平显著低于DSF/Cu,且对p-JNK的表达无明显影响。
　　 4.ROS抑制剂NAC能明显抑制DSF/Cu诱导Molt4细胞凋亡的能力,并能抑制DSF/Cu对p-JNK、p65和Nrf2蛋白表达的调节,提示ROS很可能是调控JNK、p65和Nrf2通路的关键。