人胎盘底蜕膜间充质干细胞移植潜能相关生物学特性与向多巴胺能神经元分化的体外研究

摘要

研究背景: 帕金森病(PD)是以中脑黑质纹状体区多巴胺(DA)能神经元进行性变性为主要病理特征的一类中枢慢性退行性疾病。统计学资料显示，在65岁以上老年人群中，PD的发病率以超过1％，已跃居为仅次子阿尔茨海默病严重威胁老年人健康的第二大杀手。临床上主要表现为静止性震颤、僵直、运动迟缓和姿势异常，晚期也将出现自主神经功能紊乱、感觉障碍、精神异常和认知障碍等非运动性症状，给患者身心健康、家庭和社会带来了沉重的负担。
　　 PD临床运动功能障碍主要是由黑质纹状体通路中多巴胺的严重缺失而造成。目前药物治疗（左旋多巴）能有效恢复多巴胺水平，仍然是早期临床治疗的主旋律，但长期服用会造成严重的异动和精神障碍。外科手术（脑深部电刺激术）是晚期PD患者的主要治疗选择，虽然同样能有效的控制症状，但手术费用昂贵，在缓解疾病进展方面也并没有定论。
　　 近年来，细胞替代治疗在退行性疾病（如:PD）治疗逐渐展现出广阔的前景。许多实验室和临床研究也表明替代缺失的DA神经元能改善PD运动症状，而干细胞由于其独特的生物学特性逐渐成为了主要的细胞来源。干细胞体外可被诱导分化为DA神经元的研究结果是细胞移植治疗PD的理论基础。胚胎干细胞(ESCs)是从发育早期胚囊内细胞团分离出来的一种未分化细胞，具有利于移植的各种优势，也能被诱导分化为神经干细胞(NSCs)或神经前体细胞(NPCs)，随后进一步分化为DA神经元。尽管如此，ESC在细胞移植方面的应用面临了巨大的限制，比如伦理束缚、易形成畸胎瘤。诱导多能干细胞(iPSCs)的发现虽曾一度带来了新的希望，但是有研究表明iPSCs比其他类型多能干细胞有更高的基因畸变频率，意味着更容易诱发肿瘤。因此，成体干细胞又重新成为了众多研究者们的焦点。
　　 间充质干细胞(MSCs)可以自我更新，并可分化为不同的细胞谱系，这些均是干细胞移植治疗的重要特征和先决条件，在生物医学和组织工程中具有巨大的科研价值。迄今为止，尽管在许多不同的成体组织中发现了MSCs的存在，但大多数实验室和临床研究都是在阐述明确且充分的骨髓间充质干细胞(BMSCs)引导下进行的。然而，由于骨髓的获取过程有创易出现感染，以及其数量、分化能力和基因稳定性均随年龄的增大而下降。因此，在过去的几十年，探索新干细胞来源的研究从未停止过。
　　 人类胎盘是在妊娠过程中的一个暂时性器官，由分别来自于胎儿和母体的胎膜层和底蜕膜层组成。在哺乳动物妊娠过程中，胎儿被作为半异体移植体，在妊娠期并不会受到母体免疫细胞的攻击和排斥。胎盘在这个免疫耐受过程中起到重要作用，而发挥此作用的核心部位是构成母胎界面的母体蜕膜组织。有趣的是，越来越多的研究表明在足月胎盘的两个组成部分里均含有大量的MSCs。其中，胎膜来源的MSCs(FMMSCs)由于来自胎儿而被推测具有多向分化潜能。确实，先前研究表明FMMSCs体外可被诱导分化为中胚层的心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞，内胚层的胰岛细胞、肝细胞以及外胚层的神经元、星形胶质细胞。而且这些结果同样在体内模型（心肌梗死和PD大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓损伤灵长类动物模型）中得到了证实，进一步说明了FMMSCs移植可产生功能性效用。相反，底蜕膜来源的MSCs(decidua basalis-derived MSCs，DBMSCs)很可能由于其母体来源而极少受到关注。In't Anker等首先描述了DBMSCs的分离和扩增潜能。此外，另有研究表明DBMSCs的生长对缺氧和血清剥夺环境具有抵抗作用，可能为因局部缺血所造成的细胞凋亡提供更好的替代治疗。但迄今为止，对于DBMSCs在遗传稳定性和增殖能力等方面的研究却鲜有，而这些特性与其移植潜能密切相关。
　　 与移植潜能相关的另一重要课题乃是移植后免疫排斥问题。免疫调节功能是MSCs用作细胞治疗的一个极具吸引力的特征。重要的是，中枢神经慢性炎性反应是PD发生和发展的主要病理学基础，许多动物实验表明缓解黑质纹状体区的炎症反应是减缓DA神经元退化的有效手段。值得注意的是，炎症虽然长期被认为是大脑修复的阻碍，但同时也可通过分泌趋化因子促使干/祖细胞募集和迁移，这也恰巧构成了干细胞移植治疗PD的良好微环境。相反，一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)等炎症介质可促使蛋白异常修饰而导致错折叠和功能缺失，进一步加剧神经退变。MSCs借助于其特有的免疫调节功能，通过细胞接触或分泌可溶性细胞因子对有害免疫炎性组分的调控抑制黑质区微环境中的免疫活性，进而对DA神经元起到保护作用，为PD细胞移植治疗打开了一扇新的窗户。近年来，FMMSCs由于其低免疫原性（高表达HLA-G抗原、低表达HLA-Ⅱ抗原）吸引了众多学者的目光。另外，通过分裂素或同种异体细胞进行混合淋巴细胞共培养试验证实FMMSCs具有免疫抑制作用。然而，在母胎免疫中发挥更重要作用的母体侧蜕膜组织中的DBMSCs的免疫学特性尚未见报道。
　　 基于上述研究背景，试图从胎盘母体侧底蜕膜组织中分离并鉴定DBMSCs;从基因稳定性、增殖能力和免疫学特性等角度分析其移植潜能;并进一步研究其体外分化为DA神经元的能力，评价其在将来PD治疗方面的应用前景。
　　 第一章人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离及鉴定
　　 目的:探索有效的DBMSCs体外分离、纯化方法，建立稳定的培养体系，并从表型和功能方面进行鉴定。
　　 方法:通过酶消化法和密度梯度离心法从人足月胎盘（37-41孕周，男性胎儿）底蜕膜中获取间充质干细胞，采用限制性稀释法纯化获取单细胞来源的克隆团，倒置显微镜下观察其形态变化和生长特点;流式细胞仪检测细胞周期及表面抗原(CD14，CD29，CD31，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，CD106)的表达;免疫细胞化学检测内皮细胞标记血管性血友病因子(vWF)、间质细胞标记波形蛋白(vimentin)、成纤维细胞标记D7-FIB、成骨细胞标记碱性磷酸酶(ALP)、成软骨细胞标记Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ)和脂肪细胞标记周脂素(perilipin)的表达，显微镜下随机选取10个视野(×200)计算阳性率。在特定的诱导条件下，使其向成骨、成脂、成软骨方向分化，鉴定其多向分化潜能。所有数据采用均数±标准差（(X)±SD）方式进行统计学描述。
　　 结果:人足月胎盘底蜕膜中分离的间充质干细胞起初呈现不规则形态，仅少量贴壁生长，7天后主要呈现成纤维细胞样长梭形，细胞生长缓慢，约在第14天形成克隆团，每个克隆团约100-200个细胞组成，大约3周后可达融合状态;传代后细胞生长速度明显加快，呈旋涡状生长;经限制性稀释培养后，单细胞来源的DBMSCs克隆团表现为均一的长梭形。流式细胞仪检测结果显示:＞70％的细胞处于静止期（G0/G1期），且这些细胞不表达造血细胞标记(CD14，CD34，CD45)和内皮细胞标记(CD31，CD106)，而典型的间充质干细胞标记(CD29，CD44，CD73，CD90，CD105)呈阳性表达。免疫细胞化学结果显示:仅少量DBMSCs表达公认的内皮细胞标记vWF(4.0±1.2％)，而大多数细胞表达间质细胞标记vimentin（98.2±2.4％）和成纤维细胞D7-FIB（99.1±1.6％），在经诱导前成骨细胞标记ALP、成软骨细胞标记collagenⅡ和脂肪细胞标记perilipin均未见表达，而经诱导后茜素红染色、油红O染色和Alcian blue染色均呈阳性表现。
　　 结论:人胎盘底蜕膜虽然来源于母体，同样含有丰富的间充质干细胞，这种细胞具备一般MSCs基本特性，包括呈克隆样贴壁生长、表达典型的MSCs表面标记以及具有向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等中胚层分化潜能。
　　 第二章人胎盘底蜕膜间充质干细胞移植潜能相关生物学特性
　　 目的:通过对DBMSCs基因稳定性、增殖能力、免疫调节功能等生物学特性的深入探索，评价其在于细胞移植治疗方面的应用潜能。
　　 方法:将单细胞来源的DBMSCs分两组，一组连续培养3周，血球计每周计数两次，绘制生长曲线;另一组连续长期培养3月，获取晚期代数细胞。染色体核型分析早、晚期代数DBMSCs的染色体核型变化。原子力显微镜(AFM)、透射电镜(TEM)观察晚期代数DBMSCs细胞骨架结构及亚细胞超微结构。密度梯度离心法体外分离人外周血单核细胞(PBMCs)，联合DBMSCs建立混合淋巴细胞共培养(MLCs)体系，在PBMCs经植物凝血素(PHA)或同种异体PBMCs刺激后，CCK-8法分析DBMSCs对PBMCs增殖抑制作用;流失细胞仪分析MLCs中淋巴细胞的凋亡情况及Treg细胞(CD4+CD25high)比例;实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测MLCs中DBMSCs可溶性细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-10（IL-10）、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)和人类白细胞抗原-G(HLA-G)的表达情况。FMMSCs作为对照。所有数据采用均数±标准差（(X)±SD）方式进行统计学描述;多组间比较采用单向方差分析，DBMSCs体外生长动力学分析采用析因设计资料的方差分析，两个独立样本的均数比较采用两独立样本的t检验，可溶性细胞因子表达部分采用两独立样本非参数秩和检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
　　 结果:通过描绘早期代数DBMSCs生长曲线图，结果提示DBMSCs在经过11天的潜伏期后进入对数生长期，且自此往后的检测点(d11、d14、d18、d20)，其细胞数量明显高于FMMSCs(p＜0.05);整个过程中DBMSCs始终保持上升的生长势头，而FMMSCs在末期生长表现为下降的趋势。经过3个月的长期连续培养，我们获取了第16-24代晚期DBMSCs。原子力显微镜观察下DBMSCs呈长梭型，部分可见大的扁平状细胞，可见与细胞长轴平行的微丝束，细胞骨架明显，由微管、微丝、中间纤维形成立体的网状结构，边缘复杂，有触突状骨架伸出，对维持细胞的形态、细胞的运动和物质运输起着关键的作用。细胞核大，核膜清晰，核仁明显，部分细胞核可见多个核仁。细胞间连接也可见微管及微丝结构，形成细胞间的网状连接，提示细胞间存在相互通讯和物质交换的可能。透射电镜显示细胞呈长梭形，细胞膜完整，在高倍镜下，细胞表面可见散在的丰富的类似微绒毛结构，可能与胎盘固有的附着能力有关。细胞间的连接以紧密连接为主，部分区域可见缝隙连接，说明细胞间存在粘合和通讯的交互作用。细胞多为单核，偶见双核，核浆比例大，核膜清晰，外膜外表面附有核糖体，具有合成蛋白质的功能，核仁一个或多个，由核仁丝缠绕成海绵球体状，少量的异染色质分布在核周边区，常染色质占多数，是间期核处于伸展部位的染色质，电子密度低，利于RNA的复制，部分细胞可见核仁边集现象，这可以使核仁合成的各种RNA更迅速的释放在胞质中，表明细胞代谢活跃。胞浆内可见散在的粗面内质网，其上附着丰富的游离核糖体，说明正在大量合成细胞分裂和生长所需的蛋白质，这从侧面反应了细胞增殖活跃，细胞分化程度较低。细胞的线粒体为管状嵴结构，与内分泌细胞的线粒体的超微结构相似。染色体核型分析结果显示:所有受检的晚期代数DBMSCs样本均和早期代数细胞一样保持正常染色体核型(46，XX);由于所有胎盘样本均来自与男性胎儿，此结果也侧面反应了我们所分离的细胞单纯来源于母体组织，而并未受胎儿组织细胞的污染。MLCs实验结果表明:无论细胞-细胞接触方式和Transwell，DBMSCs类似FMMSCs可抑制促细胞分裂素和同种异源诱导的淋巴细胞增殖，并且呈浓度依赖性。流式细胞仪AnnexinV/PI染色检测细胞凋亡结果显示:MLCs对照和共培养体系中淋巴细胞未见明显的凋亡，两者差异无统计学意义（t=-1.340，P=0.229）。流式细胞仪分析与DBMSCs共培养后CD4+CD25high细胞的变化情况，结果显示:MLCs体系中经PHA刺激，与DBMSCs共培养3天后，CD4+CD25high细胞比例相比对照组增高了5倍以上。Q-PCR结果提示:除TGF-β(Z=-0.289, P=0.773)外，IL-10(Z=-2.309, P=0.021)、iNOS(Z=-2.309, P=0.021)、COX-2(Z=-2.309,P=0.021)、IDO(Z=-2.309,P=0.021)和HLA-G(Z=-2.309,P=0.021)等抗炎因子的表达量相比未处理DBMSCs明显升高，差异具有统计学意义。
　　 结论:人胎盘底蜕膜间充质干细胞具有较强的增殖活性，体外长期连续培养可保持稳定正常的染色体核型，且具有明显的免疫抑制作用，是干细胞移植治疗良好的细胞种子来源。
　　 第三章人胎盘底蜕膜间充质干细胞向多巴胺能样神经元分化
　　 目的:探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞体外分化为多巴胺能样神经元的潜能，并分析这种潜能是否受长期培养影响.进而评价其在PD治疗方面的应用前景。
　　 方法:采用早期第3代和经长期培养3个月后第19代单细胞来源DBMSCs依照两步法进行诱导。第一步:神经球(NSs)诱导，细胞换新鲜基础培养基孵育过夜，胰蛋白酶消化后用含表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和B27等细胞因子的诱导培养基进行诱导。同时，通过光学显微镜下分别计数两种不同代数细胞的成球率来评价他们的成球能力。第二步:DA神经元诱导，将NSs消化成单个细胞后，用含音猬因子(SHH)、成纤维细胞生长因子8(FGF8)、脑源性生长因子(BDNF)和毛猴素的诱导培养基重悬后接种于层粘连蛋白包被的培养板中连续诱导7-10天。第一步诱导后光学显微镜下观察NSs形态和生长特点，免疫细胞化学和Western blot检测神经干细胞(NSC)标记Nestin和CD133的表达;第二部诱导后光学显微镜下观察DA神经元细胞形态改变，免疫细胞化学和Western blot检测成熟神经元标记神经特异性的烯醇化酶(NSE)、神经胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和DA神经元特异性标记酪胺酸羟化酶(TH)的表达情况。采用图像分析软件分析Western blot条带灰度，以β-actin作为标准化内参。电化学-高效液相色谱法分析诱导前后培养上清中DA含量变化。所有数据采用均数±标准差（(X)±SD）方式进行统计学描述;早、晚期代数来源的NSs成球能力及DA神经元神经递质分泌量比较采用两个独立样本的t检验，早、晚期代数DBMSCs来源的DA神经元标记表达率比较采用两独立样本非参数秩和检验，P＜0.05认为具有统计学意义。
　　 结果:当DBMSCs经过第一步NSs诱导后，起初几天大多数细胞仍呈贴壁生长，在第3天开始出现小的细胞团，这些细胞团（并非所有）体积逐渐增大，约8-10天形成漂浮生长的细胞球，第3代和第19代细胞来源的NSs光学显微镜下观察形态学上无差异，免疫细胞化学检测提示两种不同来源的NSs均高表达神经干细胞标记Nestin和CD133，Western blot结果与免疫细胞化学结果相符。而晚期代数DBMSCs来源的NSs形成数量明显低于早期代数来源的NSs（3.889±0.674 vs6.778±0.752），差异具有统计学意义(t=4.958，p=0.000)。当NSs经过第二步DA神经元诱导后，细胞呈现出长梭形分枝状的神经元样形态，两种代数来源的神经元祥细胞均表达成熟神经元标记NSE（62.250±4.935 vs56.650±6.890％，Z=-1.441，p=0.180）、神经胶质细胞标记GFAP(42.800±6.160 vs40.867±10.686％，Z=-0.641，p=0.589)和DA神经元特异性标记TH（19.050±5.585 vs17.233±2.680％，Z=-0.320，p=0.818）。Western blot结果同样证实了TH蛋白的表达，且电化学-高效液相结果显示:相比诱导前，两种不同来源细胞诱导后培养上清DA含量均有升高(P3:t=-23.002，p=0.000; P19:t=-15.756，p=0.000)，差异具有统计学意义。此外，两种不同代数细胞诱导前后DA分泌量（P3 vs P19:156.033±8.206vs144.640±12.435 pg/ml，t=1.325，p=0.256）无明显区别，差异均无统计学意义。
　　 结论:人胎盘底蜕膜间充质干细胞体外可分化为多巴胺能样神经元，且这种分化能力不受体外长期培养的影响，可能成为PD干细胞移植治疗的有效细胞来源。

目录

摘要

前言

第一章 人胎盘底蜕膜问充质干细胞的分离及鉴定

一、引言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第二章 人胎盘底蜕膜问充质干细胞移植潜能相关生物学特性

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第三章 人胎盘底蜕膜问充质干细胞向多巴胺能样神经元分化

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

全文总结

参考文献

中英文对照和缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明