Id1/Id3在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞生物学的作用

摘要

背景：
　　 分化抑制因子(inhibitor of DNA differentiation，Id) Id蛋白可与碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix)转录因子作用，形成非活性异二聚体，阻止bHLH与靶基因DNA上的E启动子结合，间接地抑制分化相关基因的表达，影响肿瘤细胞的生长、血管形成、侵袭及转移能力，其中Id1/Id3具有许多重叠效益，在促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移方面具有协同作用，被认为是与肿瘤侵袭性相关的上游调控基因。
　　 近年来，基因治疗、靶向治疗作为肿瘤治疗的新生代模式日益受到重视。但目前对于子宫内膜癌的治疗还没有发现特有效的特异性标志物，对于生长转移的分子机理也缺乏一定的了解。关于Id1/Id3基因与子宫内膜癌发生、发展及侵袭转移的关系还没有相关研究。我们希望借此研究子宫内膜癌生物学行为的发生、发展及浸润转移机制，寻找一种新的治疗策略。
　　 目的：
　　 检测Id1/Id3在子宫内膜癌组织中的表达情况。利用RNA干扰技术构建Id1/Id3双敲低腺病毒并感染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952，通过观察Id1/Id3双敲低后，对MMP2，CXCR4和P21在基因水平和蛋白水平的影响，推测Id1/Id3与P21、MMP2和CXCR4的关系，以及是否参与它们介导的细胞存活、细胞增殖或趋化相关信号转导通路，研究子宫内膜癌细胞的浸润、增生及转移的机制。重点探讨双敲低Id1/Id3基因对子宫内膜癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力及粘附能力的影响，阐明Id1/Id3基因在子宫内膜癌生长转移中的生物学作用，检验干扰Id1/Id3是否可以有效治疗子宫内膜癌，为临床诊断和治疗提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.Western blot检测Id1、Id3在子宫内膜癌组织内表达:
　　 将随机挑选的南方医科大学南方医院妇产科2011年6月-2011年10月住院手术的4例子宫内膜癌患者新鲜组织及相应的癌旁组织提取全蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量，测定其在562nm处的吸收值(A562)。计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。提取的总蛋白，加入2×SDS蛋白上样缓冲液（按1∶1比例），100℃煮沸5min，-20℃保存备用。Westernblot方法检测后观察凝胶图像，应用Adobe Photoshop图像软件扫描Western blot凝胶图片，得到相应灰度值，观察4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中的Id1/Id3的表达。
　　 2.qRT-PCR检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC-1-B和RL-952细胞株后Id1、Id3、MMP2、CXCR4、P21mRNA水平:
　　 实验将两株细胞各分为未处理细胞组(简写control)、空白病毒组(vector)、启动子病毒组(promoter)、Id1/Id3双敲低组(RNAi)。对四组细胞进行提取RNA、去基因组、纯度检测和电泳检测、逆转录及定量PCR操作。采用ΔΔCT法对荧光定量PCR结果进行定量分析，计算Id1/Id3双敲低后MMP2、CXCR4、P21的表达抑制率。
　　 3.Western blot检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC-1-B和RL-952细胞株后Id1、Id3、MMP2、CXCR4、P21蛋白表达量:
　　 对每株细胞的各四组细胞提取全蛋白，具体步骤同前。
　　 4.噻唑蓝(MTT)比色实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞增殖能力的影响:
　　 对RL-952及HEC-1-B细胞株各四组细胞加入MTT后，以空白对照孔调零，酶联免疫监测仪上490nm测定各孔光吸收值（D值）。各组取三孔平均值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。
　　 5.移行小室（Transwell）侵袭实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞侵袭能力的影响，一般随机选取6个高倍视野计数穿过膜的细胞数。
　　 6.细胞划痕实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞迁移能力的影响:按0h,6h,12h,24h,48h取样，以未处理的细胞为对照，拍照后使用phoshop的标尺测量致伤区域的像素。
　　 7.细胞粘附实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞粘附能力的影响:细胞拍照后经过MTS法处理，每小组做6个复孔。
　　 8.统计学处理采用SPSS14.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中Id1/Id3表达的比较采用两独立样本t检验，其余实验组间比较采用ANOVA单因素方差分析，两两比较采用Tamhane‘s T2检验;检验水准a=0.05。以P≤0.05为有统计学差异。
　　 结果：
　　 1.Id1在4例子宫内膜癌组织中表达上调，与癌旁组织中表达量相比具有统计学差异(F=9.656 t=0.000);Id3在子宫内膜癌组织中表达亦上调，与相应癌旁组织中表达量相比具有显著性差异(F=14.600 t=0.000)。
　　 2.对于HEC-1-B细胞，Id1/Id3双干扰后，Id1 mRNA表达水平明显抑制(F=283.920 P=0.000)，Id3 mRNA表达水平明显抑制(F=318.073 P=0.000)，CXCR4 mRNA表达量明显抑制(F=185.749 P=0.000)，MMP2 mRNA表达量明显抑制(F=57.383 P=0.000)，P21mRNA表达量升高(F=37.590 P=0.000)。对于RL-952细胞，Id1/Id3双干扰后，Id1 mRNA表达抑制(F=211.715 P=0.000)，Id3 mRNA表达抑制(F=228.218 P=0.000)，CXCR4 mRNA表达水平降低(F=99.462 P=0.000)，MMP2 mRNA表达水平降低(F=19.060 P=0.001)，P21 mRNA表达水平升高(F=104.071 P=0.000)。
　　 3.对于HEC-1-B细胞，Id1/Id3双干扰后，Id1蛋白表达明显抑制(F=454.836P=0.000)，Id3蛋白表达明显抑制(F=34.112 P=0.000)，CXCR4蛋白表达抑制(F=510.178 P=0.000)，MMP2蛋白表达抑制(F=286.765 P=0.000)，P21蛋白表达升高(F=1757.754 P=0.000)。对于RL-952细胞，Id1/Id3双干扰后，Id1蛋白表达抑制(F=882.161 P=0.000)，Id3蛋白表达抑制(F=1190.847 P=0.000)，CXCR4蛋白表达抑制(F=963.998 P=0.000)，MMP2蛋白表达抑制(F=145.342P=0.000)，P21蛋白表达升高(F=4799.080 P=0.000)。除P21 Id1/Id3双敲低组与启动子组比较无统计学差异(P=0.998)外，RNAi与其他组相比均有统计学意义。
　　 4.噻唑蓝(MTT)比色试验检测证实双敲低Id1/Id3表达后抑制HEC-1-B和RL-952细胞的增殖能力:HEC-1-B细胞转染病毒12h后，经统计学分析，未处理细胞组、空白病毒组、启动子组和Id1/Id3双敲低组均数相比具有显著性差异(F=19.358 P=0.001);转染24h后四组均数相比具有显著性差异(F=26.536P=0.000);转染48h后均数相比具有显著性差异(F=30.078 P=0.000);RL-952细胞转染病毒12h后，经统计分析，四组均数相比具有显著性差异(F=4.557P=0.038);转染24h后四组均数相比具有显著性差异(F=14.059 P=0.001);转染48h后四组均数相比具有显著性差异(F=28.356 P=0.000);绘制生长曲线可见干扰Id1/d3表达后，细胞的生长活力明显降低，且在48h时间点增殖能力最低。
　　 5.Transwell侵袭实验检测证实双敲低Id1/Id3表达后抑制HEC-1-B和RL-952细胞的侵袭能力:未处理细胞组、空白病毒组、启动子组和Id1/Id3双敲低组穿膜到达下室的HEC-1-B细胞数均数经统计学分析存在显著性差异(F=79.116P=0.000)，且RNAi组细胞数最低，与其他三组比较均有显著性差异(P＜0.001);四组穿膜到达下室的RL-952细胞数均数存在显著性差异(F=85.899 P=0.000)，且RNAi组与其他三组比较有统计学意义(P＜0.001)。
　　 6.细胞划痕实验检测证实双敲低Id1/Id3表达后抑制HEC-1-B和RL-952细胞的迁移能力:对于RL-952细胞，划痕6h后四组之间迁移率有显著性差异(F=124.307 P=0.000)，划痕12h后四组之间迁移率有显著性差异(F=106.879P=0.000)，划痕24h后四组之间迁移率有显著性差异(F=25.808 P=0.000)，划痕48h后四组之间迁移率有显著性差异(F=49.600 P=0.000)，且划痕48h后，RNAi组与其他三组相对比迁移速度最慢，迁移距离最小，划痕距离并未见明显缩小，P＜0.001，有统计学意义。对于HEC-1-B细胞，划痕6h后四组之间迁移率有显著性差异(F=51.267 P=0.000)，划痕12h后四组之间迁移率有显著性差异(F=15.869 P=0.001)，划痕24h后四组之间迁移率有显著性差异(F=15.179P=0.001)，划痕48h后四组之间迁移率有显著性差异(F=51.066 P=0.000)，且划痕48h后，RNAi组与其他三组相对比迁移速度最慢，迁移距离最小，划痕距离并未见明显缩小，P＜0.05，有统计学意义。
　　 7.细胞粘附实验证实双敲低Id1/Id3表达后能够抑制HEC-1-B和RL-952细胞的粘附能力:RL-952细胞中未处理细胞组、空白病毒组、启动子组和Id1/Id3双敲低组D值相比存在显著性差异(F=40.314 P=0.000)，且经统计学分析RNAi组与其他三组比较均有统计学意义;HEC-1-B细胞中，四组D值相比存在显著性差异(F=48.945 P=0.000)，且Id1/Id3双敲低组与未处理细胞组、空白病毒组和启动子组比较均有显著性差异。
　　 结论：
　　 1.Id1/Id3在子宫内膜癌组织中高表达，与癌旁组织中的表达量相比具有显著性差异，成为我们检验抑制Id1/Id3是否可以有效治疗子宫内膜癌的依据。
　　 2.双敲低Id1/Id3后，MMP2和CXCR4在mRNA水平及蛋白水平表达均降低，P21在mRNA水平及蛋白水平表达均升高，较未经任何处理的子宫内膜癌细胞有显著性差异。我们推测Id1/Id3能够在基因及蛋白水平明显升调MMP2和CXCR4的表达，降调p21的表达，从而上调细胞周期蛋白CDK2、CyClin E、CDK1、Cyclin B的表达，进而上调非磷酸化Rb蛋白表达，促进子宫内膜癌细胞的增殖、血管生成、侵袭与转移。可见，Id1/Id3为P21、MMP2和CXCR4的上游调控基因，可参与它们介导的细胞存活、细胞增殖或趋化相关信号转导通路，抑制子宫内膜癌细胞的浸润、增生及转移。
　　 3.Id1/Id3双敲低后，子宫内膜癌细胞株的增殖能力、侵袭能力、迁移能力及粘附能力明显抑制。
　　 总之，Id1/Id3在子宫内膜癌的发生发展中发挥重要作用，可作为子宫内膜癌基因治疗的靶点，但是Id1/Id3在子宫内膜癌中的详细作用机制仍需要进一步研究。

目录

摘要

前言

实验材料

1 细胞株与病毒

2 子宫内膜癌组织

3 试剂与仪器

4 Id1／Id3干扰靶点序列

5 Id1、Id3、MMP2、CXCR4、P21的引物序列

实验方法

1 Western blot检测Id1、Id3在子宫内膜癌组织内表达

2 rPEG3-RNAi-AD感染细胞RL-952预实验筛选最佳感染时间点

3 qRT-PCR检测不同腺病毒载体转染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952后，ID1、ID3、MMP2、CXCR4、P21的mRNA表达水平

4 Western blot检测不同腺病毒载体转染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952后，ID1、ID3、MMP2、CXCR4和P21蛋白表达水平

5 噻唑蓝(MTT)比色实验检测病毒感染对细胞增殖能力的影响

6 Transwell侵袭小室实验检测病毒感染对细胞侵袭能力的影响

7 细胞划痕实验检测病毒感染对细胞迁移能力的影响

8 细胞粘附实验检测病毒感染对细胞粘附能力的影响

9 统计学处理

实验结果

1 Id1、Id3在子宫内膜癌组织内表达

2 rPEG3-RNAi-AD感染细胞RL-952预实验筛选最佳感染时间点

3 不同腺病毒载体转染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952对ID1、ID3、MMP2、CXCR4、P21的mRNA的影响

4 不同腺病毒载体转染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952对ID1、ID3、MMP2、CXCR4、P21蛋白的影响

5 MTT比色细胞增殖实验

6 Transwell侵袭实验

7 细胞划痕实验

8 细胞粘附实验

讨论

1 Id1／Id3在子宫内膜癌中的表达及意义

2 P21在子宫内膜癌细胞中的表达及与Idl／Id3的关系

3 MMP2在子宫内膜癌细胞中的表达及与Id1／Id3的关系

4 CXCR4在子宫内膜癌细胞中的表达及与Id1／Id3的关系

5 Id1／Id3在子宫内膜癌中的表达对子宫内膜癌细胞生物学的作用

结论

第六章 不足与展望

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读学位期间的成果

致谢

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