黄连素预处理对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的机制研究

摘要

研究背景： 冠心病是导致人类死亡的主要原因，全球每年约有380万男性和340万女性死于冠心病。急性心肌梗死最理想的治疗措施是在冠状动脉已通的基础上实现心肌水平的完全再灌注，即心肌微循环再灌注的实现，它包括心外膜血管再灌注与心肌组织再灌注两个方面。对于前者，在溶栓，PCI以及CABG发展成熟的今天，达此目标已成现实。而对于后者，如何防治再灌注损伤及改善心肌组织再灌注正是急需解决的问题。急性心肌梗死动物模型研究提示，致死性再灌注损伤最多可占心肌梗死最终体积的50％，因此，防治心肌缺血再灌注损伤可以提高急性心肌梗死再灌注疗法的临床疗效，有关方面的研究已成为热点，但迄今为止还没有可用于临床的药物。 自噬是细胞内自我降解细胞器和蛋白的过程，自噬体通过与溶酶体结合，参与细胞内的降解过程，自噬在细胞的分化，生存，及其稳态的维持中起到了至关重要的作用。细胞自噬通过降解细胞内不稳定的蛋白质以及遭到破坏的细胞器，减轻其对细胞的损伤作用，分解得到氨基酸等细胞代谢所必须的底物，维持细胞的自身稳态。国外有研究证实缺血再灌注过程能够诱导自噬水平的快速上调。国内越来越多的研究发现自噬在许多病理生理学状态中扮演重要作用，例如肿瘤、感染、心脏疾病、神经退行性疾病等。自噬的调节被认为与心血管系统疾病相关，包括心肌病、心肌肥大、缺血性心脏病、心衰和缺血再灌注损伤等。自噬在缺血再灌注损伤中的作用可能与损伤时期相关。动脉粥样硬化斑块巨噬细胞内观察到自噬体增多。自噬可能通过防止细胞凋亡和斑块坏死起到稳定粥样斑块的作用。 黄连素是中药黄连的主要提取物，用于治疗腹泻、痢疾等胃肠道感染性疾病，近年其它研究者的动物实验及临床试验研究证明黄连素具有显著的降血糖，降血脂的作用，随着对黄连素的深入研究发现，除对糖尿病的血糖血脂的调节作用外，黄连素对抗血小板，抗动脉粥样硬化也有显著的疗效。药理研究还证明黄连素具有抗氧化作用，而黄连素在自噬方面的研究目前仍未有报道，因此本实验采用体外的缺血再灌注模型，在细胞水平模拟心肌缺血再灌注损伤，来观察黄连素对其损伤的保护作用及可能的机理。 目的 研究报道细胞自噬通常作为一个保护性的机制参与细胞的保护作用，如抗感染，抑制肿瘤细胞增殖抑制神经变性，防衰老，防再灌注性损伤。广泛参与了肿瘤、心脏缺血、神经退行性疾病、代谢性疾病、呼吸系统疾病等病理生理学过程和衰老等生理学过程。综合上述资料，我们从细胞水平上探讨:1.建立H9C2心肌细胞缺氧复氧模型以模拟缺血再灌注损伤，在细胞水平上证实黄连素预处理对H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤的作用。2.培养H9C2心肌细胞，建立心肌细胞缺氧复氧模型，从细胞水平探讨黄连素对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用的机制，为缺血再灌注损伤的防治提供新的途径。3.探讨干预自噬后黄连素保护心肌细胞缺氧复氧损伤的机制。 对象与方法 第一部分实验:我们首先培养了大鼠心肌H9C2心肌细胞，探讨缺氧复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤的时间点，实验分为5组:对照组，缺氧4h复氧3h组，缺氧4h复氧6h组，缺氧4h复氧9h组，缺氧4h复氧12h组，分别用倒置显微镜下观察细胞生长状态，MTT检测细胞活性，检测培养液中LDH活力和心肌细胞MDA及SOD含量以观察H9C2心肌细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 第二部分实验:培养大鼠心肌H9C2心肌细胞，确定缺氧4h复氧6h为缺氧复氧模型最佳时间点，实验分为3组:对照组，缺氧复氧组，BBR+缺氧复氧组。MTT检测细胞活性，检测培养液中LDH活力和心肌细胞MDA及SOD含量，Western Blotting检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达，基因转染检测GFP-LC3基因表达，通过荧光显微镜检测MDC染色的颗粒和透射电子显微镜检测自噬小体，采用Rh-123作为荧光探针应用流式细胞仪检测H9C2心肌细胞线粒体膜电位(△ΨM)。通过透射电子显微镜观察线粒体膜肿胀的变化情况。 第三部分实验:我们通过药物干预自噬表达，观察黄连素在H9C2心肌细胞中保护作用机制，实验分为5组:control组，H/R组，Ra+H/R组，3-MA+BBR+H/R，BBR+H/R组，MTT检测细胞活性，检测培养液中LDH活力和心肌细胞MDA及SOD含量，流式和TUNNEL检测细胞凋亡情况，Western Blotting检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达，基因转染检测GFP-LC3基因表达，通过荧光显微镜检测MDC染色的颗粒和透射电子显微镜检测自噬小体，采用Rh-123作为荧光探针应用流式细胞仪检测H9C2心肌细胞线粒体膜电位(△ΨM)。通过透射电子显微镜观察线粒体膜肿胀的变化情况。 结果： 1.培养H9C2心肌细胞，建立细胞缺氧复氧模型， MTT实验检测H9C2心肌细胞活性的变化。与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧4h复氧6h，9h，12h后，细胞的存活率显著性下降，有显著统计学意义(p＜0.01)。分别对体外培养心肌细胞检测培养液中LDH活力和心肌细胞MDA及SOD含量，结果显示:与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧4h复氧6h，9h，12h后，LDH和MDA分别显著增加，而SOD值则显著降低，有显著统计学差异(p＜0.01)，（见图1-3，表1-2）。利用Alexa Fluor488Annexin YFITe/Pl双染色法进行流式细胞仪检测。结果如图1-4所示，H9C2心肌细胞凋亡率与缺氧复氧的时间密切相关，在在经过缺氧复氧后，细胞的凋亡率率明显升高。与对照组相比，H9C2心肌细胞缺氧4h复氧6h，9h，12h后，细胞的凋亡率显著性升高，有显著统计学意义(p＜0.01，n=5)。 2.我们利用免疫印迹法分析BBR在各组中自噬蛋白表达的情况。研究结果显示， H/R损伤诱导H9c2心肌细胞中的自噬标志物表达增强（图2-4）。与对照组相比，各种自噬标志物的表达水平在在H/R损伤时表达上调(P＜0.05)。同时，我们观察到在BBR组的Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平进一步增强(P＜0.05，图2-4)。然后，我们利用基因转染的方法把GFP-LC3载体蛋白转入各组H9C2心肌细胞进而观察细胞自噬变化（如图2-4）。另外，我们通过MDC染色法也证实了自噬的变化，在缺氧复氧过程中增加，BBR组进一步增加自噬的表达（如图2-5）。最后，我们通过透射电子显微镜观察自噬小体的变化情况。结果显示，与对照组相比，H9C2心肌细胞的自噬小体在H/R组升高（P＜0.05，图2-5）。与H/R组相比，BBR组的自噬小体数量明显增多(P＜0.05)。这些数据再次表明BBR上调H9C2心肌细胞自噬小体的形成。我们采用Rh-123作为荧光探针应用流式细胞仪检测H9C2心肌细胞线粒体膜电位(△ΨM)。如图2-6所示，与对照组相比，H/R组诱导H9C2心肌细胞造成的线粒体膜电位损伤(P＜0.05)。与H/R组相比，BBR组线粒体膜电位损伤减轻（P＜0.05，图2-6）。我们通过透射电子显微镜观察线粒体膜肿胀的变化情况。如图2-6所示，透射电子显微镜分析表明，H/R损伤后，H9C2心肌细胞线粒体肿胀程度明显增高，其肿胀面积也增大（P＜0.05，与对照组相比，图2-6）。BBR组显示，其线粒体膜面积较H/R组较少，肿胀程度也减轻，这些结果表明，H/R损伤导致线粒体功能障碍。 3.然后我们通过药物干预自噬进一步探讨了黄连素在缺氧复氧损伤中的保护机制，与H/R组比较，黄连素组的LDH、MDA显著降低，SOD明显升高(P＜0.01)。3-MA组与黄连素组相比，LDH、MDA增高，SOD降低(P＜0.01)，而经过3-MA处理后，3-MA组的LDH、MDA值明显增高，SOD值明显降低，与H/R组无统计学差异(P＞0.05);3-MA是自噬抑制剂，说明抑制自噬后，黄连素心肌细胞保护作用被减弱。黄连素组和雷帕霉素组的LDH、MDA和SOD之间没有差异，(P＞0.05)。然后我们利用MTT检测细胞活性，结果显示，与control组相比， H/R组的细胞活性明显降低(P＜0.01)。与H/R组比较，黄连素组的细胞活性明显升高(P＜0.01)。结果表明，黄连素组对H9C2心肌细胞H/R损伤的保护作用表现在反映细胞细胞活性明显升高。而经过3-MA处理后，3-MA组的细胞活性明显降低，与H/R组无统计学差异(P＞0.05);3-MA是自噬抑制剂，说明抑制自噬后，黄连素心肌细胞保护作用被减弱。黄连素组和雷帕霉素组的细胞活性明显增高(P＞0.05)。我们利用流式和TUNNEL检测比较各组H9C2心肌细胞氧复氧损伤中对细胞凋亡的影响，结果显示，与H/R组比较，黄连素组的凋亡明显减轻(P＜0.01)。结果表明，黄连素组对H9C2心肌细胞H/R损伤的保护作用表现在细胞凋亡明显减轻。而经过3-MA处理后，3-MA组的细胞凋亡明显增加，与H/R组无统计学差异(P＞0.05);3-MA是自噬抑制剂，说明抑制自噬后，黄连素对心肌细胞抗凋亡作用被减弱。黄连素组和雷帕霉素组的细胞活性明显增高(P＞0.05)。与H/R组比较，黄连素组的自噬蛋白Beclin-1和LC3的表达明显增加(P＜0.01)。结果表明，黄连素组诱导细胞自噬。而经过3-MA处理后，3-MA组的自噬明显减少。黄连素与雷帕霉素组细胞自噬蛋白明显增加(P＜0.01);黄连素组和雷帕霉素组之间没有差异，(P＞0.05)。另外，检测各组H9C2心肌细胞H/R损伤中细胞自噬小体GFP-LC3的表达，与H/R组比较，黄连素组的细胞自噬小体GFP-LC3的表达明显增加(P＜0.01)。结果表明，黄连素组诱导细胞自噬。而经过3-MA处理后，3-MA组的自噬明显减少。黄连素与雷帕霉素组细胞自噬小体GFP-LC3明显增加(P＜0.01);黄连素组和雷帕霉素组之间没有差异，(P＞0.05)，说明黄连素诱导自噬的水平与雷帕霉素基本一致。我们又利用MDC染色和TEM检测比较各组H9C2心肌细胞H/R损伤中对细胞自噬小体的影响。在H/R过程中，BBR组进一步增加自噬的表达。结果显示，与H/R组比较，黄连素组的MDC染色的质粒的表达明显增加(P＜0.01)。结果表明，黄连素组诱导细胞自噬小体。而经过3-MA处理后，3-MA组的自噬小体明显减少。黄连素与雷帕霉素组细胞自噬蛋白明显增加(P＜0.01);黄连素组和雷帕霉素组之间没有差异，(P＞0.05)，说明黄连素诱导自噬的水平与雷帕霉素基本一致。最后，我们通过透射电子显微镜观察自噬小体的变化情况。结果显示，与H/R组比较，黄连素组的自噬小体表达明显增加(P＜0.01)。结果表明，黄连素组诱导细胞自噬小体。而经过3-MA处理后，3-MA组的自噬小体明显减少。黄连素与雷帕霉素组细胞自噬蛋白明显增加(P＜0.01);黄连素组和雷帕霉素组之间没有差异，(P＞0.05)，说明黄连素诱导自噬的水平与雷帕霉素基本一致。最后，我们采用Rh-123作为荧光探针应用流式细胞仪检测H9C2心肌细胞线粒体膜电位(△ΨM)。结果显示，与control组相比， H/R组的△ΨM明显升高(P＜0.01)。与H/R组比较，黄连素组的△ΨM明显降低(P＜0.01)。结果表明，黄连素组对H9C2心肌细胞H/R损伤的保护作用表现在反映细胞△ΨM水平降低。而经过3-MA处理后，3-MA组的△ΨM明显升高，与H/R组无统计学差异(P＞0.05);黄连素组和雷帕霉素组的△ΨM明显减低(P＜0.01)。黄连素组和雷帕霉素组之间没有差异，(P＞0.05)。我们通过透射电子显微镜观察线粒体膜肿胀的变化情况。结果表明，透射电子显微镜分析表明，H/R损伤后，H9C2心肌细胞线粒体肿胀程度明显增高，其肿胀面积也增大(P＜0.05)。而经过3-MA处理后，3-MA组的线粒体肿胀面积明显升高，与H/R组无统计学差异(P＞0.05);黄连素组和雷帕霉素组的线粒体肿胀面积明显减低(P＜0.01)。黄连素组和雷帕霉素组之间没有差异，

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 H9C2心肌细胞株的培养和缺氧／复氧模型建立

1．研究背景

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

第二章 黄连素对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用的机制研究

1．研究背景

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

第三章 干预自噬后黄连素对心肌细胞缺氧／复氧损伤中保护作用的机制研究

1．研究背景

2．方法

3．结果

4．讨论

5．结论

参考文献

全文总结

综述 自噬在心肌缺血再灌注过程中的作用

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学证明