RNA干扰特异性阻断胰岛局部RAS对胰高血糖素分泌功能的影响及其机制

摘要

本研究利用db/db小鼠为研究对象，观察其胰岛局部AT1R的表达，通过腺病毒介导RNA干扰（RNAinterference，RNAi）特异性抑制胰岛局部AT1R的表达，观察其对胰岛素相关信号通路分子表达的影响，并利用胰岛灌流评估其胰高血糖素及胰岛素动态分泌功能，探讨其可能的作用机制，进而揭示胰岛局部RAS在内分泌胰腺中的作用及与2型糖尿病的关系，为寻找糖尿病防治药物的新作用靶点拓展新思路。具体研究分为以下三个部分:
　　第一章 db/db糖尿病小鼠胰岛局部血管紧张素Ⅱ1型受体的表达
　　目的：
　　观察db/db小鼠胰岛局部AT1R的表达，以进一步揭示胰岛局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用。
　　方法：
　　选取15只8周龄无特定病原体(SPF)级雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠及15只同周龄同窝出生的C57BL/KsJ-db/m小鼠。分离培养db/db和db/m小鼠胰岛，荧光实时定量PCR(qRT-PCR)及Westem blot检测AT1R mRNA和蛋白的表达。
　　结果：
　　db/db小鼠胰岛AT1R mRNA及蛋白的表达水平均为db/m小鼠胰岛的3倍左右，差异均有统计学意义[mRNA:（320-25）％vs(100±8)％，P＜0.05;蛋白:（310±20）％vs(100±8)％)，P＜0.05]。
　　结论：
　　db/db糖尿病小鼠胰岛局部AT1R过度表达。
　　第二章 db/db糖尿病小鼠胰岛局部AT1R基因RNA干扰重组腺病毒的构建
　　目的：
　　构建AT1R基因靶向RNAi重组腺病毒，并在293包装细胞中扩增制备重组病毒。
　　方法：
　　由生物公司合成针对db/db小鼠AT1R mRNA的特异性小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表达质粒psiRNA-AT1R;双酶切得到 siRNA-AT1R表达片段;插入pAdTrack载体上，获得转移质粒pAdTrack-siRNA-AT1R;后者经线性化处理后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组;PacⅠ酶切鉴定，筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-AT1R;酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒Ad-siAT1R，荧光显微镜观察绿色荧光表达，行PCR鉴定。通过反复感染扩增病毒，以氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒。同法扩增空载病毒Ad-siControl至相当量，并纯化。
　　结果：
　　PacⅠ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-AT1R构建成功:于荧光显微镜下观察到pAdEasy-siRNA-AT1R转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达;PCR鉴定说明重组腺病毒中含siRNA-AT1R片断，成功构建了携带含AT1R干扰RNA的重组腺病毒Ad-siAT1R，在293包装细胞中扩增后，利用氯化铯梯度离心纯化法获得约3.6×109efu/ml滴度的重组腺病毒。
　　结论：
　　利用AdEasy-1系统可快速高效制备表达AT1R干扰RNA的重组腺病毒，为进一步研究胰岛局部RAS在胰高血糖素分泌功能中的作用奠定了基础。
　　第三章 胰岛灌流评估db/db小鼠胰岛局部AT1R基因沉默后的胰高血糖素动态分泌功能
　　目的：
　　观察AT1R基因靶向RNAi重组腺病毒对db/db小鼠胰岛中AT1R表达以及IRS、PI3K调节亚基p85[PI3K(p85)]以及磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p-Akt2）的表达，并利用离体胰岛灌流系统评估胰岛素及胰高血糖素动态分泌情况，探讨其可能的机制。
　　方法：
　　db/db小鼠胰岛过夜培养，分为3组处理:Ad-siAT1R组，按MOI100，加入Ad-siAT1R病毒液，作用2小时，更换新培养液;空病毒组:以不表达任何目的基因的腺病毒Ad-siControl用相同的MOI感染;空白对照组:同等条件下培养但未行任何干预处理的胰岛。胰岛继续培养48小时，此后检测AT1R、IRS-1、IRS-2、P13K(p85)及p-Akt2表达，并利用胰岛灌流评估胰高血糖素及胰岛素动态分泌。
　　结果：
　　1、与Ad-siControl组相比，Ad-siAT1R组AT1R mRNA和蛋白表达水平显著下降;
　　2、Ad-siAT1R组IRS-1、IRS-2、PI3K(p85)及p-Akt2蛋白表达水平Ad-siControl组均显著上调;
　　3、胰岛灌流显示Ad-siAT1R组在高糖刺激1-2min后，胰岛素分泌急剧上升达到高峰140 mU/L，为基础水平的2.8倍，而其胰高血糖素分泌立即出现显著性下降，达14pmol/L，与基础值相比，下降13pmol/L;而Ad-siControl组在高糖刺激1-2min时胰岛素分泌也出现一定程度的升高，峰值仅为90 mU/L，为基础值的1.8倍，其胰高血糖素分泌逐渐下降至35pmol/L，仅比基础值下降5pmol/L。
　　结论：
　　RNAi技术特异性抑制胰岛局部RAS显著改善了db/db小鼠胰高血糖素的过度分泌情况，这可能得益于胰岛素分泌增加导致的抑制作用增强，但是否与α细胞胰岛素敏感性相关，有待采用α细胞株进一步研究探明。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 db／db小鼠胰岛局部AT1R的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 db／db小鼠胰岛局部AT1R基因RNA干扰重组腺病毒的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 胰岛灌流评估db／db小鼠胰岛局部AT1R基因沉默后的胰高血糖素动态分泌功能

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

小结

攻读学位期间发表论文

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致谢

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