人多能干细胞分化而来的平滑肌前体细胞治疗压力性尿失禁大鼠的研究

摘要

压力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI）是指在咳嗽、喷嚏、大笑等腹压增高时出现的不自主地尿液渗漏。SUI是女性最为常见的尿失禁类型，尤其是老年妇女。SUI症状经常发生在日常活动中，因此严重影响患者的生活质量和社交活动，亦带来心理精神负担。SUI发病机制尚不明确，但尿道固有括约肌功能不全（Intrinsic sphincter deficiency，ISD）是导致SUI的重要因素。ISD主要由于尿道括约肌的平滑肌层或横纹肌层或其支配神经出现损伤引起。具有ISD的SUI患者通常有更严重的尿失禁症状，且对常规的治疗反应不佳。当保守治疗失败后，必须进行手术治疗。目前首选的手术治疗方式，如中段尿道悬吊术等，仅是增加对尿道的支持、固定作用，并不涉及对损伤或老化的尿道括约肌进行组织重建。而这类手术的长期成功率约为40-50％，有很大一部分患者会出现术后复发的情况。手术的局限性及逐渐进展的尿道括约肌平滑肌层老化衰退被认为是导致术后复发的原因。因此，有效恢复受损的尿道括约肌是需要积极探索的重要治疗方式。
　　干细胞因其具备自我更新和多向分化的潜能，可应用于SUI患者的尿道括约肌再生，这引起了研究领域的极大兴趣。目前，已有成体干细胞（肌肉来源、泌尿系来源、脂肪来源、骨髓来源等）在SUI动物研究或临床研究中表现出在排尿功能的恢复、组织学的改善方面有较好的效果。但是，这些成体干细胞的临床应用仍存在众多问题，如提取的自体干细胞数量有限、细胞扩增准备时间过长、移植细胞为多种细胞类型混合、携带表观遗传改变等等。这些障碍不利于干细胞疗效的优化，也影响了我们对干细胞具体作用机制进行深入研究。因此，为避免上述问题，人胚胎干细胞或诱导多能干细胞或许可以成为新的干细胞来源。另外，现阶段的干细胞实验主要修复的是尿道外括约肌（横纹肌），尚未有仅针对尿道内括约肌（平滑肌）再生的研究报道。研究人员发现，在SUI研究中应用最广的成体间充质干细胞在体内仅有一小部分能够分化为平滑肌细胞，而由于成体间充质干细胞移植混杂有多种细胞类型，分化而来的平滑肌细胞是否对尿道括约肌功能重建有促进作用及有关机制都无法明确。
　　目的:我们试图探索人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞(Induced pluripotent stemcells，iPSCs)分化而来的单一平滑肌前体细胞(Progenitor smooth muscle cells，pSMCs)对重建SUI动物模型尿道功能的作用及机制。首先，通过在不同时间点对不同SUI大鼠建模方式的建模效果进行比较，以期找到更稳定更适宜干细胞移植研究的长期SUI模型。在此基础上，分化而来的pSMCs在移植入SUI大鼠尿道周围一段时间后，根据LPP和尿道外周括约肌肌电图（Electromyography，EMG）基线的测试，判断尿道功能的恢复情况。根据尿道括约肌组织学检查、细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)主要组成弹性纤维和胶原纤维的蛋白比较、移植细胞体内融合实验等分析平滑肌前体细胞恢复尿道功能的作用机制。
　　方法:1、根据终末观察时间的不同将150只产后SD大鼠随机分为三个独立实验:1周短期观察实验、4周和8周长期观察实验。每个实验中，大鼠随机分为对照组、尿道松解组、耻骨-尿道韧带损伤（Pubo-urethral ligament injury，PULI）组和多次阴道球囊扩张组(Multiple vaginal distention，MVD)。除对照组及1周短期实验中的尿道松解组和PULI组外，其余组均在手术的同时附加了双侧输卵管卵巢切除术(Bilateral salpingo-oophorectomy，BSO)。1周短期观察实验通过Crede法对三个时间点进行漏尿点压力(Leak point pressure，LPP)测试:术前、术后立即和术后一周。4周和8周长期观察实验通过Crede法和垂直-倾斜板(vertical tilt tabel，VT)法在术后4周和8周的终末时间点对LPP进行测试。术后8周LPP测试后收集大鼠的尿道进行组织学分析。2、108只成年未经产的Rowett裸鼠随机分为四组:对照组（无干预）、生理盐水组（手术+生理盐水注射）、膀胱平滑肌细胞(Bladder smoothmuscle cells，BSMC)组（手术+人BSMC注射）、平滑肌前体细胞(pSMCs)处理组（手术+pSMCs注射，包括人胚胎干细胞H9、游离型载体介导重编程的iPSC（Episomal reprogrammed induced pluripotent stem cells，Epi-iPSC）、逆转录病毒介导重编程的iPSC分化而来的pSMCs）。根据第一部分实验得出的更好的SUI建模方式对Rowett nude(RNU)大鼠进行手术。手术后3周，在尿道周围注射分化好的平滑肌前体细胞（2×106个细胞/只）。注射5周后测试LPP和尿道外周括约肌EMG基线。3、对H9-pSMCs实验中的四组（正常对照组、生理盐水组、BSMC组、H9-pSMCs组）的尿道组织，进行平滑肌特异性蛋白、骨骼肌肌动蛋白双重免疫荧光染色，评价尿道括约肌肌层的变化;进行弹性纤维、胶原蛋白双重染色，评价尿道ECM结构的变化;RT-qPCR检测大鼠尿道组织中的人弹性蛋白、人ERV-3，判断H9-pSMC是否在大鼠体内大量增殖及分化;Western Blot比较四组大鼠尿道组织中的弹性蛋白、胶原蛋白Ⅲ含量，对组织学结果进行验证;在5只SCID小鼠单侧后肢长收肌注射荧光素标记的1×106H9-pSMCs，进行体内生物信号BLI追踪，并对注射部位的组织进行切片染色检测pSMCs移植后的融合情况。
　　结果:1、在1周观察实验中，尿道松解组术后立即（33.69±2.27 cmH2O）和术后1周时的LPP（39.34±2.08 cmH2O）与术前（50.40±1.99 cmH2O）(p＜0.05)相比显著降低。MVD+BSO组的术后一周LPP(35.17±1.76 cmH2O)与术前(49.39±4.44 cmH2O)(p＜0.05)相比也有同样的结果;在4周观察实验中，各组与对照组相比均没有显著差异;而在术后8周时，仅有尿道松解组经VT法测得的的LPP与对照组相比显著降低(28.26±1.11 vs38.89±3.91 cmH2O)(P＜0.05)，其余组LPP均无差异。组织学结果也证实术后8周时，尿道松解组尿道中的弹力纤维和胶原纤维破坏得最为严重。2、iPSC分化而来的平滑肌前体细胞处理组，不论是游离型载体方法重编程的iPSC(N=9，mean=19.4±1.33 cm H2O)，还是逆转录病毒方法重编程的iPSC(N=8，mean=18.45±1.41 cm H2O)，与生理盐水组(N=14，mean=14.16±1.07 cm H2O)(p＜0.05)相比，LPP显著升高，与尿道功能恢复相一致。而H9分化的平滑肌细胞处理组的LPP(N=22，mean=16.66±0.74 cm H2O)与生理盐水组(N=10，mean=15.52±1.09 cm H2O)的差异并不显著，但仍然显示出了其LPP向正常对照组的LPP水平(N=13，mean=18.75±0.96cm H2O)靠拢的发展趋势。3、尿道组织学显示H9-pSMCs处理的大鼠尿道与生理盐水组相比具有更丰富的弹性纤维和更厚的肌层。Western blot结果证实H9-pSMCs处理组的大鼠尿道和膀胱中的弹性蛋白、胶原蛋白含量显著增加。人弹性蛋白的基因表达在大鼠尿道组织中未检测到，说明细胞外基质的合成是来源于大鼠自身组织，而不是移植的人类细胞。严重联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的体内pSMCs生物信号追踪和免疫荧光染色结果证明pSMCs可以长期存活，并融合入SCID小鼠组织且表达平滑肌细胞表型。
　　结论:尿道松解术方法建立的SUI大鼠模型较为稳定，更适宜干细胞移植研究;人多能干细胞（hESC和iPSC）分化而来的平滑肌前体细胞可以恢复括约肌功能，这一发现为多能干细胞分化大量平滑肌细胞用于泌尿系统的功能恢复提供了可能性;H9-pSMC的尿道周移植能够促进大鼠受损尿道的结构重建，其作用机制包括通过旁分泌调节ECM代谢、刺激自身括约肌修复、pSMC可能增殖并整合入再生的括约肌肌层。本研究首次揭示人多能干细胞(H9hESC、iPSCs、Epi-iPSCs)来源的pSMCs能够恢复SUI大鼠的尿道功能。iPSCs来自自体细胞，能够减少宿主免疫排斥反应，同时也避免了hESCs应用的伦理问题。本研究使用的iPSCs有两种诱导方式，一种是通过逆转录病毒，这种方式可以使病毒颗粒整合到宿主基因组中，导致基因突变，因而不能应用于临床，另一种是通过非整合方式诱导完成的Epi-iPSCs，对人体相对无害。因此，Epi-iPSCs来源的pSMCs非常有希望在SUI治疗的实际临床中得到应用。另外，我们通过对H9-pSMC的作用机制研究发现，pSMC主要通过某种旁分泌作用调节大鼠自身尿道的ECM代谢，帮助受损尿道括约肌的修复，也不排除pSMC分化增殖并整合入大鼠的尿道括约肌层。

目录

摘要

引言

一、压力性尿失禁的概况

二、发病机制

三、动物模型

四、治疗手段

五、本实验研究

第一部分 压力性尿失禁大鼠模型的建立

前言

材料与方法

讨论

小结

第二部分 平滑肌前体细胞治疗压力性尿失禁大鼠的作用研究

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分 平滑肌前体细胞治疗压力性尿失禁大鼠的机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 干细胞移植治疗压力性尿失禁的研究进展

致谢

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