健康人、腹泻儿童与鼠形动物肠道肺炎克雷伯菌的病原学特征和耐药性分析

摘要

目的：
　　比较和分析不同来源（动物、病人与健康人）肠道中肺炎克雷伯菌的血清型、基因型以及耐药特征，探究在社区环境中，鼠形动物携带的肺炎克雷伯菌与人群分离的耐药性与高毒力菌株之间的关系，为更好地预防和控制多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌引起的社区获得性感染提供基础数据。
　　方法：
　　(1)2015年5-9月，在广东省南方医科大学第三附属医院检验科连续收集健康人与儿科门诊腹泻儿童的粪便样本，将收集的粪便样本置于运送培养基于(2～8)℃暂时保存当天运送回实验室，同时采集健康人和门诊腹泻儿童的基本信息;
　　(2)同时期，在广东省白云区南方医院及其附件以及周围居民区（约为65万平方米范围）按照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》(SN/T2788-2011)相关标准利用笼捕法捕鼠。鼠笼布置地点为建筑物墙边、下水道、垃圾堆、仓库、厨房、垃圾桶、水沟等地点;以“晚放晨收”形式每月捕鼠一次，连续捕鼠5个月;捕获的鼠形动物按要求立即运送至实验室，按照《实验动物细菌学检测标本采集》(GB/T14926.42-2001)要求解剖并采集鼠形动物粪便样本;
　　(3)所有收集的粪便样本按照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》(SN/T2788-2011)相关标准分离肺炎克雷伯菌，根据2014年美国临床和实验室标准协会制定的抗菌药物敏感性试验标准（CLSI标准）采用纸片扩散法(K-B法)对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢替坦、头孢呋辛、头孢他啶、阿莫西林-克拉维酸、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、复方新诺明、氯霉素、呋喃妥因、美罗培南共19种抗菌药物进行敏感性试验，依照2014年CLSI标准筛检产ESBLs菌株，同时利用聚合酶链式反应(PCR)实验方法检测产ESBLs菌株中SHV、TEM和CTX-M三种耐药基因;
　　(4)对分离培养的所有肺炎克雷伯菌利用细菌DNA基因组提取试剂盒提取核酸，通过PCR实验方法筛检高毒力肺炎克雷伯菌荚膜血清型（包括K1、K2、K5、K20、K54和K57六种血清型），同时对该六种高毒力血清型菌株进行药敏试验，通过PCR实验方法检测该六种高毒力血清型菌株中magA、wcaG、rmpAuge、 kfu和Aerobactin六种毒力基因;根据MLST官网的参考文献的实验方法进行MLST分析。
　　(5)全部数据整理并且输入Excel表格，采用SPSS20.0版软件进行汇总分析。采用x2检验（或Pearson Chi-Square或Fisher's Exact Test）进行率的比较，以P＜0.05作为有显著性差异的判定标准。
　　结果：
　　(1)2015年5-9月期间，共收集健康人粪便样本275份、腹泻儿童粪便样本105份，肺炎克雷伯菌检出率分别为66.2％(182/275)和65.7％(69/105)。共捕获鼠形动物190只，包括105只鼩鼱、80只褐家鼠、3只小家鼠和2只黄胸鼠，捕获率为26.8％;鼩鼱捕获率高于褐家鼠、小家鼠和黄胸鼠(x2=189.834，P＜0.001)，褐家鼠捕获率显著高于其他家鼠(x2=147.225，P＜0.001)，然而鼩鼱与褐家鼠的捕获率差异无统计学意义。肺炎克雷伯菌在鼠形动物粪便样本检出率为78.4％(149/190)，小家鼠和黄胸鼠粪便样本中均未检出肺炎克雷伯菌。鼠形动物肠道中肺炎克雷伯菌携带率高于健康人和腹泻儿童(x2=9.266，P=0.010)。
　　(2)所有肺炎克雷伯菌均对氨苄西林耐药。健康人粪便样本检出182株肺炎克雷伯菌的抗生素药物敏感试验结果:青霉素类抗生素哌拉西林敏感率为19.2％;第一代头孢类抗生素头孢唑林敏感率为2.2％;第三代头孢类抗生素头孢噻肟、头孢他啶敏感率为35.2％和65.4％;第四代头孢类抗生素头孢吡肟敏感率为54.4％;喹诺酮类、磺胺类、碳青霉烯类抗生素敏感性较高。腹泻儿童粪便样本所检出69株肺炎克雷伯菌抗生素药敏试验结果:哌拉西林敏感率为19.2％;头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟敏感率分别为1.4％、46.4％、82.6％和69.6％;喹诺酮类、磺胺类、碳青霉烯类抗生素敏感性较高。鼠形动物粪便样本所检出149株肺炎克雷伯菌对哌拉西林敏感率为10.7％;鼠形动物携带的肺炎克雷伯菌对头孢唑啉耐药情况严重，敏感率为3.4％;头孢噻肟和头孢他啶敏感率分别为36.9％和65.1％;头孢吡肟敏感率为67.8％;喹诺酮类、磺胺类、碳青霉烯类抗生素敏感性较高。健康人、腹泻儿童和鼠形动物肠道中肺炎克雷伯菌多重耐药率分别为47.8％、29.0％和40.9％，其中腹泻儿童多重耐药率最低(x2=7.382，P=0.025);三者产ESBLs菌株阳性率分别为17.0％、14.5％和10.7％，差异无统计学意义(x2=2.661，P=0.264)。对产ESBLs菌株进行耐药基因检测，产CTX-M和TEM型酶菌株阳性率分别为38.6％(22/57)和28.1％(16/57)(x2=1.421，P=0.233)，未检出产SHV型酶菌株。在健康人、腹泻儿童和鼠形动物中，TEM型检出率没有统计学意义上的差异(x2=5.585，P=0.061)，CTX-M型在腹泻儿童检出率最高(x2=9.039，P=0.011)，但是，在健康人与鼠形动物样本中检出率差异没有统计学意义(x2=0.032，P=0.858)。
　　(3)400株肺炎克雷伯菌经PCR检测得，K1、K2、K5、K20、K54和K57六种高毒力肺炎克雷伯菌血清型检出率分别为:1.0％、1.0％、1.5％、0.8％、0.5％和1.2％。其中，健康人和腹泻儿童粪便样本共检出16株（检出率为6.4％），K1、K2、K5、K20、K54和K57检出率分别为1.6％、1.6％、0.4％、0.8％、0.8％和1.2％。在鼠形动物粪便样本共检出8株（检出率为5.4％），K5、K20、K57检出率分别为3.4％，0.7％和1.3％，未检出K1、K2、K54血清型;所有K1和K2分离株对大部分抗生素敏感，然而K5、K20和K57分离株对青霉素类和第一代头孢类抗生素耐药严重，部份K5和K57分离株对第三代头孢类抗生素耐药。高毒力分离株毒力基因uge、kfu、wcaG、aerobactin、rmpA和magA检出率分别为95.8％、33.3％、29.2％、29.2％、29.2％和16.7％。magA基因仅存在于K1型分离株，而uge在六种血清型均可检出。所有K1型分离株与K20、K54和K57部分分离株检出wcaG基因。除了K2型分离株之外，其他血清型均可检出kfu基因。在高毒力分离株中，大部分STs为首次出现的基因型，而临床感染常见的ST23、ST86、ST37和ST65同时也在健康人和腹泻儿童样本中检出，并且首次在鼠形动物标本中检出临床患者常见的ST268基因型。
　　结论:
　　(1)健康人与腹泻儿童肠道中肺炎克雷伯检出率无统计学意义上的差异，但是二者的检出率均低于鼠形动物肠道中肺炎克雷伯菌的检出率。
　　(2)健康人、腹泻儿童和鼠形动物粪便样本中肺炎克雷伯菌分离株对青霉素类、头孢类抗生素耐药情况严重，特别是对第一代和第三代头孢类抗生素，但对喹诺酮类、磺胺类、碳青霉烯类抗生素敏感率较高。鼠形动物与人类共处同一生活环境，携带的肺炎克雷伯菌耐药谱及耐药基因型与健康人相似，提示鼠形动物可能成为多重耐药肺炎克雷伯菌的储存宿主和传染源。
　　(3)虽然鼠形动物与人群样本的肺炎克雷伯菌高毒力血清型分布不完全一致，但是部分高毒力血清型在鼠形动物以及人样本中均能检测到。在健康人和腹泻儿童样本中检出K1、K2、K5、K20、K54和K57六种高毒力荚膜血清型，其中以K1、K2和K57检出率较高;在鼠形动物粪便标本中，K5、K20和K57检出率最高，但未检出K1、K2和K54型。K1和K2型分离株对大部分抗生素敏感，而K5、K20和K57型分离株对青霉素类和头孢类抗生素耐药率较高。magA是K1型菌株重要的毒力因子并且仅存在于K1型分离株;wcaG存在于K1、K20、K54和K57型分离株，与其强毒力有关;rmpA与aerobactin的平行关系提示二者可能协同发挥毒力作用。
　　(4)鼠形动物、健康人和腹泻儿童肠道中均可以检出作为社区获得性感染重要病原体的高毒力肺炎克雷伯菌常见基因型，提示肠道该型克雷伯菌可能在家鼠及人之间传播。

目录

摘要

1．前言

2．材料与方法

2．1．材料

2．2．方法

2．3．统计学分析

3．结果

3．1．健康人、腹泻儿童和鼠形动物样本的收集情况

3．2．健康人、腹泻儿童和鼠形动物肠道中肺炎克雷伯菌检出率

3．3．肺炎克雷伯菌药敏试验结果

3．4．高毒力肺炎克雷伯菌株检测及其耐药性调查

3．5．高毒力分离株的毒力基因检测与MLST分析

4．讨论

5．全文总结

5．1．主要发现

5．2．创新性

5．3．研究意义

5．4．不足之处

5．5．下一步研究计划

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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