丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的制备与鉴定

摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是一种主要通过血液传播，在全世界广泛流行的RNA病毒，可引起急、慢性肝炎，肝硬化和肝癌[1-3]。截止至2002年全球共有超过1.8亿人感染HCV[4]，仅中国的发病率就高达3.2％，是HCV感染的高流行区[5]。因此控制HCV的传播已经成为一个相当严峻的全球性公共卫生问题。
　　目前常规的HCV检测多以HCV抗体检测和HCV核酸检测为主[6,7]，由于人体感染HCV后有72天左右的窗口期[8]，在此期间抗体尚未达到试剂盒的可检测滴度，从而容易造成漏检，严重威胁用血安全[9];虽然HCV核酸检测可以有效缩短检测窗口期，但存在对操作人员要求高、检测过程复杂易污染、所用试剂和仪器价格昂贵等缺点，以致于不能广泛应用于血液样本的常规检测[7，10]。研究表明，HCV核心蛋白(core)在病毒颗粒复制表达时，将结合部分病毒RNA形成病毒的核衣壳[11-13]，因此在一定条件下，HCV core蛋白的检测结果可用于预测HCV的核酸复制情况，不但可以达到简化检测方法、提高检测效率、有效缩短病毒检测的窗口期的目的，还可以反映患者体内HCV病毒复制情况，并作为评价临床HCV抗病毒治疗效果的指标[14,15]。本研究目的在于筛选出高灵敏性和特异性的HCV core单克隆抗体用以检测血清中的HCV core Ag，为HCV core Ag诊断试剂盒的研发奠定基础。
　　通过对HCV core进行基因序列和蛋白结构分析，发现HCV core蛋白前1-120aa（氨基酸）包含了大多数core蛋白的保守性B细胞表位，其中21-40aa为其最具免疫原性的优势表位，且25-39aa表位与HCV阳性血清反应最好[16-25]。因此本实验以1b型HCV core蛋白序列为参照，合成HCV core21-40aa多肽蛋白，并在其羧基末端偶联载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)作为目的蛋白，最终通过常规单抗制备技术和间接ELISA法筛选单抗，成功获得11株高亲和力的抗HCV core的单克隆抗体。
　　ELISA结果表明这些抗体对合成多肽HCV core21-40aa以及原核表达重组多肽HCV core1-120aa的反应性均为100％。免疫荧光方法证明这11株抗体对体外转染于Huh7.5.1细胞内的2a型HCV病毒JFH-1的检出率为100％。用这些抗体分别通过蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测3份HCV高病毒载量病人血浆，筛选出亲和力和灵敏性最佳的两株单克隆抗体(110F8和14B5)，并将这两株抗体进一步用于60份血清样品的检测，检测结果与该60份血清样本的ELISA抗体法、巢式PCR、ROCHE荧光定量PCR的检测结果做对比。结果显示，单克隆抗体对HCV core Ag的WB检测结果与巢式PCR检测结果吻合度较强且具有统计学意义;单克隆抗体对HCV core Ag的WB检测结果与ELISA抗体法检测结果吻合度较强且具有统计学意义。以上结果皆证明单克隆抗体对天然core抗原具有较好的特异性和灵敏性。

目录

摘要

1 前言

1．1 HCV的流行病学研究

1．2 HCV基本分子生物学特性

1．3 HCV诊断

1．4 单克隆抗体技术

2 材料

2．1 主要化学试剂

2．2 主要动物，细胞及培养基成分

2．3 主要抗体

2．4 主要仪器及耗材

2．5 主要溶液配制

3 方法

3．1 抗原蛋白合成

3．2 动物免疫

3．3 小鼠免疫效价检测

3．4 细胞融合

3．5 间接法ELISA筛选单克隆细胞

3．6 腹水制备及纯化

3．7 单克隆抗体的鉴定

3．8 单克隆抗体的血清学鉴定

4 结果

4．1 HCV core21-40aa免疫效果

4．2 细胞免疫及融合

4．3 亚克隆

4．4 抗体的亚型鉴定

4．6 亲和力的测定

4．7 单抗的WB鉴定

4．8 单抗的免疫荧光鉴定

4．9 单抗在HCV core抗原检测系统中的应用

5 讨论

结论

参考文献

附录

缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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