丙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体的制备、特征分析及其应用

摘要

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要病原体之一。丙型肝炎(Hepatitis C)呈世界性分布，全球感染率约为3％，有1.7-2亿HCV感染者。HCV基因组为一单股正链RNA，约9400个碱基对(bp)，由5′及3′末端非编码区和一个大的单一开放读码框架(ORF)组成。HCV ORF编码约3011个氨基酸的病毒前体蛋白，分为结构区和非结构区。结构区基因又分为核心区(C区)和包膜区(E区)，分别编码核心蛋白和包膜蛋白(E1和E2)及P7蛋白；非结构区包括NS2、NS3、NS4和NS5基因，分别编码NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。目前HCV被划分为6个基因型，近100个基因亚型。由于HCV基因序列存在高度变异性，给丙型肝炎疫苗的研制工作带来了极大的困难，因此至今国内外尚无有效的丙肝疫苗和特效的药物。
　　HCVcore基因位于ORF第342-914核苷酸(nt)，长573nt，编码191氨基酸(aa)。HCVcore蛋白包括P21和P23两种表达形式。P23是由191个氨基酸残基组成的完整HCVcore蛋白分子，它只是一种前体蛋白形式，在细胞内进一步加工，成为由1-174氨基酸残基序列组成的多肽片段，即成熟的core蛋白形式P21。HCVcore基因保守、抗原性强、具有蛋白的免疫优势区。core蛋白氨基酸序列上有多个B、CTL、TH细胞的抗原表位，能诱导不同病毒株的交叉免疫应答。
　　HCV感染已成为全球公认的公共健康问题，然而至今国内外没有一种实验方法能可靠的区分HCV感染的急性期和慢性期，这给临床诊断及治疗方案的制定带来了困扰。为此，本研究采用HCVcore蛋白作为免疫原，制备抗HCV核心抗原(HCV-cAg)的单克隆抗体(McAbs)，对制备出的McAbs进行鉴定及特征分析；选取效价高，亲和力强的McAbs进行辣根过氧化物酶标记，建立竞争抑制酶联免疫吸附试验(ELISA)，进而通过检测急性期丙肝病人、慢性丙肝病人及体检人群血清，分析急慢性病人血清抑制率的差异，为建立鉴别急、慢性HCV感染的诊断方法奠定基础。本研究分为两部分：
　　一、HCV核心抗原单克隆抗体的制备、鉴定及其特征分析
　　首先，用基因1b型HCV-cAg免疫6周龄Balb/c雌性小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接ELISA筛选抗-HCV-cAg阳性细胞孔。阳性细胞孔经过3次亚克隆后，所有杂交瘤细胞生长孔的培养上清经ELISA检测，阳性率达到100%，表明杂交瘤细胞株已单克隆化，即建系。最终获得4株稳定分泌抗-HCV-cAg McAbs的杂交瘤细胞株，分别命名为：8B10.9G11、3F2和5A11。用其制备小鼠腹水，将所制备的腹水与HCVcore进行ELISA反应，测得腹水抗体效价分别为1:106，1:103，1:103和1:107。通过Western-blot、间接ELISA法证实所得到的不同杂交瘤细胞株分泌的McAbs特异性好，稳定性高，均属于IgGl亚类。通过硫氰酸钠(NaSCN)解离试验证明McAb5A11和9G11抗体亲和力接近(ED50:2.4M)，且较3F2(ED50:1.9M)，8B10(ED50:1.7M)抗体亲和力高。进而对单抗纯化并运用辣根过氧化物酶(HRP)标记McAb8B10，与McAb9G11、3F2、5A11进行竞争抑制试验，结果显示McAb8B10与McAb5A11针对同一抗原表位，而McAb9G11、McAb3F2与McAb8B10针对不同抗原表位。将4株McAbs与8种不同基因型或亚型的HCV-cAg(分别为1a，2a，2b，3a，3b，4，5，和6型)进行Western-blot，结果显示4株单抗与不同基因型HCV-cAg的反应性存在一定的差异，5A11和3F2与基因型2a、2b、3a、3b、5、6反应性良好，与基因型1a和4反应较弱；8B10与基因型2a、2b、3a、3b、4、5、6反应性良好，与基因型1a反应较弱；9G11与基因型2b、3a、3b、4、5、6反应性良好，与基因型1a和2a反应较弱。
　　二、5A11单克隆抗体在急性期丙肝病人、慢性丙肝病人及HCV抗体阳性体检人群血清检测中的应用
　　本试验对纯化的McAb5A11进行辣根过氧化物酶标记，运用竞争抑制ELISA法检测了22份急性期丙肝病人、23份慢性丙肝病人及25份HCV抗体阳性体检人群的血清，结果显示22份急性期丙肝病人血清有17份(77%)抑制率在40%以下，5份在60%左右；慢性丙肝病人的血清抑制率都在50%以上，其中17份(74%)的抑制率在80-100%之间。25份体检人群血清只有4份在40%以下，有21份抑制率在40%以上，其中14份(56%)在80%-100%之间。尽管以抑制率40%为标准尚不能完全区分急、慢性HCV感染，但已能够鉴别出89%的急、慢性病例。在HCV抗体阳性的体检人群中，抑制率在40%以下的比例只占16%，提示可能已有较多HCV抗体阳性的体检人员已处于慢性HCV感染状态。
　　综上所述，我们运用杂交瘤技术制备出的4株杂交瘤细胞株分泌的抗-HCV-cAg McAbs特异性好，稳定性高。McAb8B10与McAb5A11针对同一抗原表位，而McAb9G11、McAb3F2与McAb8B10针对不同抗原表位。4株单抗与不同基因型HCV-cAg的反应性存在一定差异，揭示了HCV核心蛋白的异质性。应用高滴度和高亲和力的5A11单抗在国内外首次建立竞争抑制ELISA检测急、慢性丙肝病人血清抑制率的差异，为建立鉴别急、慢性HCV感染的诊断方法奠定了基础。