黄热病毒非结构蛋白1(YFV-NS1)在病毒感染早期的诊断价值及抗YFV-NS1单克隆抗体的制备

摘要

目的：黄热病(Yellow fever，YF)是依赖蚊媒进行传播的一种急性传染病，主要流行于非洲和南美洲的热带及亚热带地区。大部分感染患者仅表现为轻微的临床症状，7～10天即可痊愈。约五分之一病例可进展为重症患者，致死率高达20％～50％。目前，黄热病的治疗仍然以对症治疗为主，缺乏安全有效治疗措施。主要依靠大规模疫苗接种来预防和控制疫情。
　　近年来，由于疫苗接种覆盖面减少及环境因素的改变，黄热病毒的传播再趋活跃。加上国际贸易及旅游业的快速发展，导致黄热病在美国南部，东非和以前不受影响的南美洲和中美洲的一些国家和地区出现新的爆发流行。目前，亚洲尚未出现黄热病的爆发流行，但是，2016年我国海关检出了多例输入性黄热病例。此外，研究报道亚洲品系埃及伊蚊可以作为黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)的载体，而我国南方多省又处于热带及亚热带地区，气候湿热，生存着大量埃及伊蚊。所以，黄热病在我国南方地区的传播风险不容忽视。
　　发展实验室检测方法，对感染者进行早期识别诊断是控制黄热病毒传播流行的关键措施之一。目前，黄热病毒感染的病原学诊断主要是以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)为基础的病毒核酸检测，基于IgM特异性抗体的血清学检测及病毒分离。不同检测方法有其优势，也存在其局限性。研发灵敏度高、特异性强、检测通量高、快速且经济的实验室早期诊断方法，是黄热病毒大规模疫情暴发时筛查疑似感染者所必需，是我国应对具有潜在威胁的重点传染病疫情的病原检测技术及核心原材料储备的有益补充。
　　黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)属黄病毒科黄病毒属，基因组全长10862bp，可编码3种结构蛋白(E，M，C)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。NS1为分泌型糖蛋白，分子量约48KDa。由于NS1在病毒感染细胞后高表达，甚至能分泌至感染动物的外周血，所以，NS1作为检测靶标已经广泛用于多种黄病毒感染的早期诊断，如：登革病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒等。推测NS1作为检测靶标用于YFV感染的早期诊断也具有潜在价值。但当前相关研究报道不多，NS1在感染动物外周血及敏感细胞培养物中产生的规律也不甚清楚。因此，本研究拟初步探索NS1在黄病毒感染诊断中的潜在价值，进一步制备针对YFV NS1的特异性单克隆抗体，为建立YFV NS1蛋白特异性检测方法奠定基础。
　　方法:首先采用分子克隆技术构建pQE30-YFV NS1重组质粒，原核表达YFVNS1重组蛋白。将YFV NS1重组蛋白免疫小鼠，获取多克隆抗体，分别作为捕获抗体和检测抗体，建立基于YFV NS1多克隆抗体的双抗体夹心酶联免疫方法(ELISA)，联合自建的荧光定量逆转录多聚酶链反应(qRT-PCR)法，动态检测YFV感染小鼠血清和培养细胞上清中病毒核酸和NS1蛋白，阐明NS1蛋白的分泌规律;进一步以YFV NS1重组蛋白免疫小鼠，筛选能稳定分泌YFV NS1特异性单克隆抗体的的杂交瘤细胞株，制备针对YFV NS1蛋白的特异性单抗。为建立YFV NS1蛋白免疫学检测方法、研究黄病毒NS1蛋白结构及功能提供实验材料。
　　研究内容具体包括以下三个方面：
　　一、黄热病毒NS1蛋白的克隆表达及免疫性鉴定
　　以黄热病毒YFV17D疫苗株RNA为模板，RT-PCR扩增出YFV NS1基因片段。将YFV17D的NS1氨基酸序列与NCBI蛋白数据库公布的70株YFV野生型病毒株的NS1氨基酸序列进行比对分析并确认其高同源性。
　　将YFV NS1基因片段导入原核表达载体pQE30，重组质粒验证连接正确后转入感受态细胞E.coli M15，经IPTG诱导表达制备YFV NS1重组蛋白。该重组蛋白经过变性溶解，纯化回收，复性透析后获得可溶性YFV NS1蛋白浓度为0.3mg/mL。利用间接ELISA和免疫印迹对该蛋白的抗原性进行鉴定，结果表明该重组YFV NS1蛋白与黄热病毒免疫小鼠腹水发生明显的反应，提示该重组YFV NS1蛋白与病毒NS1蛋白虽然空间构象不同，但仍然保留着病毒NS1蛋白的某些活性。此外，该YFV NS1重组蛋白与其它几种黄病毒属病毒（1-4型登革病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒）免疫腹水及免疫血清均有交叉反应，提示黄病毒属病毒NS1蛋白结构相似且保守。
　　二、黄热病毒NS1蛋白分泌规律的研究
　　以复性后的YFV NS1重组蛋白免疫小鼠，收集抗YFV NS1多抗血清。对免疫小鼠血清的效价及免疫性进行鉴定，结果表明，YFV NS1免疫的Balb/c小鼠血清中的多克隆抗体不仅与YFV NS1重组蛋白反应，而且与YFV感染C6/36细胞超声裂解上清中的病毒NS1蛋白反应。将10只小鼠多抗血清随机分为2组，经纯化制备抗YFV NS1多克隆抗体，一组作捕获抗体，另一组标记辣根过氧化物酶(HRP)后作检测抗体，建立双多抗夹心ELISA方法。检测YFV NS1重组蛋白的最低检测限约为200pg/mL，YFV感染C6/36细胞培养上清的最低检测限约为400pfu/mL;利用该ELISA法和实时荧光定量RT-PCR同时检测YFV感染C6/36和Vero细胞上清及乳鼠外周血内病毒复制和NS1蛋白的分泌情况。
　　结果：表明，YFV感染细胞36h后培养上清中即检测到NS1蛋白，48h后培养上清中才检测到YFV核酸;YFV感染乳鼠2天后，部分小鼠血液中可检测到的低浓度的NS1蛋白，未检测到YFV核酸;感染后第3、4天，分别有2只小鼠血液中未检测到YFV核酸，但是血清能检测出低浓度YFV NS1蛋白。说明YFV感染细胞上清及动物血清中均有NS1蛋白分泌，且NS1的检出略早于YFV。所以，NS1蛋白用于YFV感染的早期诊断具有潜在的价值。
　　三、黄热病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
　　利用YFV NS1重组蛋白免疫小鼠5次，间接ELISA测定免疫小鼠的血清学效价。当效价达到1∶50万时，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行电融合制备杂交瘤细胞。间接ELISA技术筛选出阳性克隆，再利用有限稀释法对其进行多次亚克隆，最后共筛选出12个能分泌抗YFV NS1单克隆抗体的稳定细胞株。对12株单克隆抗体的亚类进行鉴定，结果表明其中8株为IgG1亚类，2株为IgG3亚类，2株为IgG2b亚类。此外，利用间接免疫荧光，免疫印迹和间接ELISA对12株单克隆抗体的特异性进行鉴定，结果表明其中8株为黄热病毒NS1特异性单克隆抗体，2株为黄病毒属病毒NS1特异性单克隆抗体，其余2株单抗与黄病毒属部分病毒NS1发生反应。
　　结论:本研究初步探究了YFV感染细胞上清及动物血清中NS1蛋白的分泌规律，提示NS1蛋白具有YFV感染早期诊断靶标的潜在价值。此外，成功制备具有良好抗原性的YFV NS1重组蛋白，并获得了8株针对YFV NS1蛋白的特异性单克隆抗体，为进一步建立YFV NS1蛋白免疫学检测方法、研究黄病毒NS1蛋白结构及功能提供了实验材料。

目录

摘要

前言

第一章 黄热病毒NS1蛋白的克隆表达及免疫性鉴定

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第二章 黄热病毒NS1蛋白分泌规律的研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三章 黄热病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

参考文献

中英文对照缩略词表

研究成果

致谢

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