碘131标记抗血管紧张素Ⅱ1型受体单克隆抗体对肝细胞癌早期诊断价值的实验研究

摘要

研究目的
　　肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第六位、死亡率的第三位。尽管组织活检被认为是诊断肝细胞癌的金标准，但是相对于血清生物标志物检测和影像学诊断技术，组织活检更具侵入性和创伤性。目前肝细胞癌的早期诊断主要依赖于血清甲胎蛋白检测和肝脏影像学诊断技术如B超、CT、磁共振和PET-CT。但是临床资料显示，当探查到异常时，肝细胞癌往往已进入中晚期，患者已出现临床症状。因此目前临床上迫切需要一种非侵入性的监测技术早期诊断肝细胞癌。
　　分子影像整合了分子生物学、免疫学、核医学和影像诊断学技术，可以非侵入性、实时监测疾病发生发展，是目前最理想的非侵入性分子诊断技术。该技术成功实施主要依赖于特异性靶分子的发现和鉴定。尽管多项研究报道了分子影像诊断的靶分子的特征，但是迄今为止尚未发现用于肝癌的早期诊断高效特异的靶分子。因此，寻找一种能早期特异性检测肿瘤的靶向分子用于肝细胞癌分子影像学诊断已经成为目前研究的热点，也是临床肝癌早期诊断的迫切需要。
　　最近报道血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)在许多类型肿瘤中高表达。AT1R通过升高血管内皮生长因子(VEGF)，促进肿瘤生长和血管生成。但是该分子是否在肝癌中表达尚不清楚。我们提出以下科学假说:肝细胞癌组织中AT1R表达显著升高，131I-anti-AT1RmAb可能是一种潜在的新型肝癌分子显像剂，有望用于肝癌的早期诊断。
　　研究方法
　　细胞培养
　　选择小鼠肝细胞癌细胞系H22、小鼠肝细胞系NCTCclone1469、人宫颈癌细胞系Hela和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12，用RPMI1640培养基（含100u/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10％胎牛血清）、5％CO2，37℃恒温培养，常规传代。
　　动物模型
　　6～8周龄的雄性BALB/c小鼠购自山东大学实验动物中心，在无病原体条件下饲养。通过右上背部注射1×107/0.1mL的H22细胞悬液建立小鼠肝细胞癌移植瘤模型。
　　anti-AT1RmAb和同型IgG的碘化标记
　　选取50μganti-AT1RmAb或同型IgG，分别用15μLNa131I(185MBq)，通过Iodogen法碘化标记，SephadexG-25凝胶柱分离标记物。
　　放化学纯度和稳定性
　　利用纸层析法测定放化学纯度。分别将2μL131I-anti-AT1RmAb或131I-IgG加到400μL血清或盐水中。取2μL混合液加到距层析纸下缘2cm，自然挥发干燥后，分别用丙酮或乙醇∶水∶氢氧化氨(2∶5∶1)展开。充分展开后，取出层析纸晾干，切成1cm宽的条带，置于试管底部，用井型伽玛计数仪测量。放射化学纯度(％)=131I-anti-AT1RmAb或131I-IgG的放射性活性/总的放射性活性×100。在第1、6、24、48、72和96小时分别测量放化学纯度以评价标记物稳定性。
　　放射性配体结合试验
　　放射性配体结合试验在高硼硅玻璃试管中进行。饱和实验反应混合液包括200μL的H22细胞(5×106/mL)和100μL梯度浓度(0.1～32nM)的131I-anti-AT1RmAb，用1×PBS补齐到500μL体积。10-1～105nM未标记的anti-AT1RmAb和12nM131I-anti-AT1RmAb用于竞争结合实验。混合液37℃下孵育2小时，用细胞收集器分离结合的放射性配基，用WipeTest/WellCounter测量结合的放射性配基的放射性活性。将饱和实验和竞争结合实验的结果进行非线性回归分析，计算平衡解离常数(KD)、最大结合量(Bmax)、抑制常数(Ki)和半数抑制浓度(IC50)。
　　全身放射自显影
　　实验前3天饮水中加入10％KI封闭小鼠甲状腺。注射H22细胞12天荷瘤鼠建立后，小鼠尾静脉注射3.7MBq131I-anti-AT1RmAb或131I-IgG。分别于注射后的1、6、24、48和72小时行全身放射自显影。将小鼠麻醉后仰卧位四肢伸展固定在磷屏上，确保肿瘤紧贴磷屏。磷屏曝光15分钟后用CyclonePlusStoragePhosphorSystem扫描并用OptiQuantAcquisition软件分析。
　　131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的生物学分布
　　分别于注射后1、6、24、48和72小时，每组处死6只小鼠，取血液、肿瘤、对侧肌肉组织和主要器官，称重，γ计数仪测量放射性活性，计算％ID/g和T/NT比值。
　　药代动力学分析
　　分别于0、1、3、6、12、24、48、72、96和120小时于眶周静脉取血10μL，用伽玛计数仪测量放射性活性，计算分布半衰期(T1/2α)、消除半衰期(T1/2β)和平均停留时间(MRT)。
　　实时定量PCR
　　AT1R的引物序列为:有义链，5'-GAAGAACAAGCCAAGAAATGATG-3';反义链，5'-TTGATGACTCCAGGTTAGCAGAT-3'(887bp)。Trizol一步法提取细胞或组织RNA，合成cDNA，聚合酶链反应。扩增条件:94℃变性4分钟;94℃扩增30个循环，每个循环30秒;55℃1分钟;72℃1秒。利用2-△△CT法定量分析靶基因表达水平。
　　组织学分析
　　标本用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片。切片脱蜡，常规HE染色，检测组织形态学变化;用anti-AT1RmAb免疫组化染色检测AT1R的表达。Image-ProPlusv5.0.2软件定量分析AT1R蛋白的表达水平。
　　Westernblot
　　提取的H22肿瘤组织蛋白经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜、封闭，anti-AT1RmAb(1∶400)孵育过夜，HRP标记的二抗孵育2小时，ECL化学发光液发光。β-actin(1∶1000)作为内参，HeLa细胞和PC12细胞作为阳性对照。
　　统计学分析
　　利用SPSSv11.5进行统计学分析。连续型变量资料用平均数±标准误表示，用one-wayANOVA、非配对或配对t检验分析。P＜0.05认为有统计学差异。
　　研究结果
　　anti-AT1RmAb和同型IgG的碘化标记
　　131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的放化学纯度分别为92.8％和93.2％，比活度分别为35.24±5.76MBq/μmol和38.61±7.18MBq/μmol。
　　131I-AT1RmAb对AT1R的亲和力
　　放射性配体结合实验是定量检测标记抗体对目标受体亲和力的最敏感的技术。本研究获得的KD和Bmax分别为1.83±0.48nM和5361±345.3cpm，Ki和IC50分别为9.68±1.33nM和73.13±1.33nM。结果表明131I-AT1RmAb对AT1R有高亲和力。
　　131I-AT1RmAb和131I-IgG的稳定性
　　标记物放置72小时后131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的放化学纯度在血清中仍高于90％，在生理盐水中下降到了80％以下，表明它们在血清中比在生理盐水中更稳定。同一环境下两种显像剂之间无明显差异。
　　荷肝细胞癌小鼠的全身放射性自显影
　　注射碘化标记的anti-AT1RmAb或同型IgG24小时后全身放射性自显影图像显示，与131I-IgG组相比，131I-anti-AT1RmAb组的肝细胞癌显像更清楚，这种差异在48小时达到最大。结果表明，131I-anti-AT1RmAb比131I-IgG更特异地靶向肝细胞癌。
　　131I-anti-AT1RmAb和131I-IgG的体内生物学分布
　　131I-anti-AT1RmAb组肿瘤组织的％ID/g明显高于其他组织，T/NT比值在注射48小时后达到高峰。131I-IgG组肿瘤组织的％ID/g无显著增加，整个实验过程中T/NT比值保持低水平。这些结果表明，肝癌组织比其他组织摄取更多的131I-anti-AT1RmAb，而肝癌组织不选择性地摄取131I-IgG。因此，131I-anti-AT1RmAb可能是潜在的新型肝癌靶向显像剂。
　　药代动力学分析
　　药代动力学分析表明，131I-anti-AT1RmAb的药代动力学符合二室模型，包括快速分布期和缓慢清除期。T1/2α和T1/2β分别为5.7小时和156.7小时，MRT为8.8小时。
　　AT1RmRNA和蛋白的表达
　　H22细胞的AT1RmRNA水平明显高于正常肝细胞。与之一致的是，肝细胞癌组织的AT1RmRNA水平也明显高于对侧肌肉和正常肝组织。AT1R蛋白主要定位于细胞膜。H22细胞的AT1R蛋白水平明显高于正常肝细胞。与之一致，肝细胞癌组织的AT1R蛋白水平明显高于对侧肌肉和正常肝组织。此外，PC12细胞的AT1R蛋白水平高于H22和HeLa细胞。
　　研究结论
　　1、AT1R在肝细胞癌组织中高表达。
　　2、肝细胞癌能特异性地摄取131I-anti-AT1RmAb，因此有可能成为靶向肝细胞癌的潜在的分子显像剂。