甲基苯丙胺诱导α-突触核蛋白类泛素化在其异常聚集和神经毒性作用中的研究

摘要

甲基苯丙胺（Methamphetamine，METH）属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant，ATS)，当前全球METH滥用形势日益严峻，呈现出区域不断扩大、滥用率急剧增长、年龄结构低龄化等特点因此对METH的毒性及防治的研究已成为世界面临的重大课题。大量研究表明，METH主要作用于中枢神经系统，主要表现为多巴胺等单胺类神经末梢的损伤，METH可导致大脑出现与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）和帕金森病(Parkinson's disease，PD)等神经退行性病变类似的病理学改变。
　　本实验室多年来致力于METH神经毒性相关分子机制方面的研究，前期研究已经发现在体内外实验中α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)在METH所导致的多巴胺能神经元损伤、氧化应激系统失衡和线粒体功能障碍等机制中发挥重要作用。α-Syn是由140个氨基酸组成的可溶性非折叠蛋白，是PD特征性病理结构——路易氏小体(Lewy's body)的主要组成部分。目前研究证明，α-Syn的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、硝基化都在α-Syn的聚集和神经毒性中发挥了重要作用，而类泛素化修饰与α-Syn的作用机制尚不明确。
　　类泛素化蛋白(small ubiquitin-like modifier)是泛素蛋白家族成员之一，类泛素化蛋白通过E1活化酶、E2结合酶和E3连接酶的级联反应，以共价键结合到靶蛋白的赖氨酸残基上，从而调节靶蛋白的定位以及靶蛋白与其他大分子的相互作用。据报道称，在神经退行性疾病患者大脑组织中检测出类泛素化蛋白，并且SUMO-1与患者大脑内病理性包涵体共定位，说明类泛素化蛋白在神经退行性疾病中的重要性。α-Syn是类泛素化的重要底物蛋白之一，研究报道α-Syn主要通过赖氨酸96和102位点发生类泛素化，但是，关于α-Syn类泛素化在METH的神经毒性中的作用机制尚未明确。
　　目的：
　　本实验旨在阐明α-Syn类泛素化水平变化与METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集及神经毒性之间的关系，探究METH对α-Syn类泛素化及其关键酶的作用，证实METH不仅诱导α-Syn表达增加，也促使α-Syn蛋白异常聚集，通过调节α-Syn类泛素化水平变化能够影响METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集情况，影响α-Syn通过泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径的降解机制，从而证明调控α-Syn类泛素化能够减轻METH导致的α-Syn高表达、异常聚集及多巴胺能神经元损伤，为METH神经毒性分子靶向治疗提供一定的理论基础和研究方向。
　　方法：
　　1、检测METH处理SH-SY5Y细胞、C57小鼠原代神经元细胞以及C57小鼠METH亚急性中毒模型中SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集情况;
　　2、免疫共沉淀检测METH处理SH-SY5Y细胞、原代神经元细胞以及C57小鼠METH亚急性中毒模型中α-Syn类泛素化水平;
　　3、检测METH诱导SH-SY5Y细胞、原代神经元细胞中E1、E2、E3关键酶表达变化;
　　4、前期研究发现E2酶UBC9在METH诱导的α-Syn类泛素化水平下降中起关键作用，检测在SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞中过表达UBC9对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;
　　5、检测在SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞中沉默SUMO-1对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;
　　6、在SH-SY5Y细胞中转染慢病毒并筛选稳定表达细胞株，检测定点突变α-Syn类泛素化位点K96/102R对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响;
　　7、检测在C57小鼠METH亚急性中毒模型中定点突变α-Syn类泛素化位点K96/102R对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响。
　　结果：
　　1、METH诱导体内外实验中SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集情况：
　　2、METH诱导体内外实验中α-Syn类泛素化水平变化：
　　4、在体外实验中过表达UBC9对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响：
　　5、在体外实验中沉默SUMO-1对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;
　　6、在SH-SY5Y细胞中定点突变α-Syn类泛素化位点对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响：
　　7、C57小鼠METH亚急性中毒模型中定点突变α-Syn类泛素化位点对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响。
　　结论：
　　体内外模型中，METH导致SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集水平上升，并且通过下调UBC9，降低α-Syn类泛素化水平而发挥神经毒性作用。过表达UBC9升高α-Syn类泛素化水平，缓解METH导致的α-Syn高表达和异常聚集;沉默SUMO-1降低α-Syn类泛素化水平，加剧METH导致的α-Syn高表达和异常聚集。体内外模型中特异性突变α-Syn类泛素化位点K96/102R降低α-Syn类泛素化水平，加剧METH导致的α-Syn高表达和异常聚集，加剧METH导致的α-Syn通过自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体途径降解障碍。因此，α-Syn类泛素化在METH的神经毒性机制中起到保护作用，通过调控α-Syn类泛素化，能够缓解METH相关神经毒性作用。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 METH诱导α-Syn与SUMO-1在体内外模型中的表达变化

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 METH降低α-Syn类泛素化水平

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 α-Syn类泛素化水平变化对METH导致的α-Syn高表达和异常聚集的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 定点突变α-Syn类泛素化位点对METH导致的α-Syn高表达和异常聚集的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

英文缩略词注释

致谢

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