甲基苯丙胺诱导α-突触核蛋白磷酸化致异常聚集的神经毒性机制研究

摘要

目的:
　　本研究拟通过建立METH中毒的体内外模型，运用分子生物学、神经生物学等技术，初步探讨METH作用后α-Syn129位点的丝氨酸磷酸化在其寡聚体形成、神经元损伤中的作用。通过siRNA干扰技术，蛋白质印迹、免疫荧光等检测α-Syn、pS129α-Syn和α-Syn的异常聚集，同时检测凋亡maker基因（Caspase-3和PARP）蛋白表达、线粒体膜电位改变及DA等指标的检测，从而研究METH诱导的α-Syn磷酸化致异常聚集的神经毒性机制，为进一步明确α-Syn在METH神经毒性机制中的重要靶点奠定良好基础。
　　方法:
　　1.METH诱导的α-Syn异常聚集和磷酸化的检测
　　细胞实验，接种SH-SY5Y细胞至96孔板或6孔板中，在37℃和5％CO2条件下培养，待细胞长至70％汇合时，分别使用不同浓度及不同处理时间的含METH的2％FBS培养基培养24h。检测细胞METH处理后的LC25，LC50;提取细胞总蛋白，Western Blot检测对细胞凋亡等神经毒性进行观察，检测细胞α-Syn聚集体（5G4，α-Syn异常聚集的特异性抗体），pS129α-Syn蛋白的表达变化情况，选取适宜浓度建立细胞中毒模型。
　　动物实验:参考文献报道及本科室前期造模方法，建立METH亚急性中毒模型。Western Blot检测细胞α-Syn、pS129α-Syn、cleaved Caspase-3和PARP表达情况.
　　2.探究METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性的影响
　　(1)沉默PPP2R1a降低磷酸化α-Syn表达:设计并合成三条siRNA干扰序列;采用RNA干扰技术(RNAi)处理SH-SY5Y细胞Western Blot法检测pS129α-Syn检验干扰效率;选择最有效的干扰序列，采用Western Blot法和免疫荧光法检测α-Syn、pS129α-Syn、cleaved caspase-3，cleaved PARP表达变化;TUNEL法检测各组细胞凋亡情况，JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位变化情况。
　　(2)BI2536降低磷酸化α-Syn表达:细胞分为5组:空白对照组、对照+DMSO组、对照+BI2536组、给药组和BI2536+给药组，4h后，收集细胞蛋白;Western Blot法检测α-Syn、pS129α-Syn、cleaved caspase-3和cleaved PARP等表达变化;免疫荧光法检测α-Syn异常聚集变化;小鼠随机分为4组（n=10只/组），对照组、BI2536组、给药组和BI2536+给药组。在METH首次给药前24h，BI2536组和BI2536+给药组给予单次BI2536（50mg/kg，尾静脉注射）。Western Blot法检测α-Syn、pS129α-Syn、cleaved Caspase-3和PARP等表达变化;酶化学法检测DA的活性变化。
　　3.初步探究METH诱导的磷酸化α-Syn与磷酸化Tau的相互作用及神经毒性的研究
　　免疫荧光检测p-Tau、pS129α-Syn与p-Tau共表达及使用PLK抑制剂后p-Tau的表达变化。
　　结果:
　　1.METH诱导的α-Syn磷酸化的表达变化及异常聚集的检测
　　(1)0-2.5mmol/L METH处理的SH-SY5Y细胞，存活率随METH浓度增加逐渐降低，除0.5mmol/L处理组与对照组相比无显著性差异(p＞0.05)外，其他各浓度处理组与对照组比均有显著性差异(p＜0.05)。
　　(2)相比对照组，METH处理的SH-SY5Y细胞pS129α-Syn表达随METH浓度增加逐渐增高，选取METH浓度为2.0mmol/L，时间为4h，建立中毒细胞模型。
　　(3)使用特异性小鼠抗人α-Syn5G4抗体标识α-Syn的异常聚集，WesternBlot法和免疫荧光法检测结果表明:METH给药后α-Syn异常聚集表达显著增多(p＜0.01)。
　　(4)Western Blot法和免疫荧光法检测凋亡Maker基因（Caspase-3和PARP）蛋白表达，相比对照组，METH给药后表达明显升高（p＜0.05）。
　　(5)METH亚急性中毒模型组Western Blot结果表明α-Syn、pS129α-Syn、cleaved caspase-3和PARP给药组较对照组表达明显升高（p＜0.05）。
　　2.探究METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性的影响
　　2.1 沉默PPP2R1a在METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性中的作用
　　(1)沉默PPP2R1a表达后结果显示均可有效抑制METH引起的pS129α-Syn表达升高。Western Blot法检测发现PPP2R1a沉默后的SH-SY5Y细胞，METH引起的pS129α-Syn的异常升高被抑制。
　　(2)Western Blot法检测各组细胞α-Syn表达发现:相比Ctrl组，METH组pS129α-Syn显著升高（p＜0.05），而METH+siRNA＃1组细胞内pS129α-Syn相比于METH组显著降低（p＜0.05）。在共聚焦显微镜观察:METH组细胞内α-Syn发生显著聚集，沉默PPP2R1a可有效抑制METH诱导的pS129α-Syn表达，进而抑制α-Syn的聚集的发生。
　　(3)TUNEL法检测细胞凋亡情况发现:Ctrl+siRNA#1组细胞凋亡与Ctrl组无显著性差异(p＞0.05)，METH组细胞凋亡明显上升(p＜0.05)，METH+siRNA#1组细胞凋亡较METH组表达下降(p＜0.05);JC-1法检测细胞线粒体膜电位转换情况发现:Ctrl+siRNA#1组细胞较Ctrl组无明显变化(p＞0.05)，METH组细胞线粒体膜电位降低，红绿色荧光比值较降低Ctrl组明显降低(p＜0.05)，而METH+siRNA#1组较METH组比值明显升高（p＜0.05）。
　　2.2 BI2536在METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性中的作用
　　(4)BI2536可显著降低METH引起的pS129α-Syn表达升高，当BI2536浓度为0.4μM时，抑制效果最为显著（p＜0.01）。
　　(5)Western Blot法检测各组细胞和各脑区，结果发现:SH-SY5Y细胞内METH组pS129α-Syn的表达相比于Ctrl组显著升高(p＜0.05)，BI2536+METH组pS129α-Syn相比于METH组显著降低(p＜0.05)。免疫荧光与Western Blot结果一致;BI2536可明显减低METH引起的α-Syn异常聚集表达（p＜0.05）。
　　3.初步探究METH诱导的磷酸化α-Syn与磷酸化Tau的相互作用及神经毒性的研究
　　(1)相比于空白对照组，METH处理细胞后，p-Tau表达明显升高。双标记免疫荧光检查发现磷酸化α-Syn与磷酸化Tau共定位现象。
　　(2)加入BI2536后，pS129α-Syn表达明显降低，同时p-Tau表达也明显降低。
　　结论:
　　1.在METH中毒的细胞及动物模型中，METH诱导α-Syn发生异常聚集，磷酸化α-Syn表达均显著上调并产生神经毒性。
　　2.沉默PPP2R1a基因或使用PLK抑制剂后可有效减少磷酸化α-Syn的表达，降低异常聚集的神经毒性作用。
　　3.使用PLK抑制剂抑制磷酸化α-Syn的研究中，也发现磷酸化Tau表达也明显降低，提示磷酸化α-Syn是促进Tau磷酸化的重要因素。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 METH诱导的α-Syn异常聚集和磷酸化的检测

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 探究METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 初步探究METH诱导的磷酸化α-Syn与Tau磷酸化的影响作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

英文缩略词注释

攻读硕士学位期间成果

致谢

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