基于CRISPR/Cas9类植物乳杆菌基因编辑载体构建及电转化条件研究

摘要

类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum），是一种具有多种益生特性的乳酸菌。随着基因编辑技术的发展，人们对类植物乳杆菌不再是仅局限于基本的生理性能的探究，对其遗传操作的研究是目前研究的热点内容。目前已有研究表明CRISPR/Cas技术可用于乳酸菌的基因编辑。由于类植物乳杆菌复杂且致密的细胞壁结构，使得外源质粒的转入变得困难，限制其遗传操作的研究。因此本研究将从构建CRISPR/Cas基因编辑载体和探究转化条件两方面着手。 本研究以质粒pLCNICK、pLP-gba为基础，从质粒pLCNICK上扩增出Cas9启动子片段和红霉素抗性基因终止子片段，与从质粒pLP-gba扩增的LP404142融合基因CDS区片段，通过Easy Geno快速重组克隆方法克隆到线性pUC19载体上，命名为质粒A。然后从质粒pLCNICK上扩增出包含卡那霉素抗性基因-gRNA基因的长片段，和包含启动子与终止子的红霉素抗性基因片段，克隆到线性pUC19载体上，命名为质粒B。最后把质粒A上启动子-LP404142-终止子片段与质粒B上卡那霉素-gRNA-红霉素基因片段和质粒pLCNICK的Cas9基因片段融合成一个质粒，命名为质粒C。质粒C经双酶切和测序检验正确，可以进行类植物乳杆菌的基因编辑研究。 本研究用质粒pMG36e，来探究类植物乳杆菌的电转化条件。影响转化效率的各种单因素实验和正交实验结果显示:制备感受态细胞合适条件是类植物乳杆菌在含2％甘氨酸的MRS培养基（并含0.3mol/L蔗糖）中培养6h，合适的电转化条件是质粒添加量15μg，在电压1.6kV、电容25μF和电阻400Ω程序下电击，电击完成后复苏培养2h，转化效率可以达到145.50(CFU/μg DNA)。 我们构建的质粒C，将为类植物乳杆菌基因功能研究提供方便，另外我们的转化方法也可以为其它革兰氏阳性菌的转化提供借鉴。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1乳酸菌概述

1．2基因编辑技术概述

1．3．1 CRISPR／Cas系统组成及分类

1．3．2 CRISPR／Cas系统作用机制及应用

1．3．3 CRISPR／Cas9系统在乳酸菌中的应用

1．4乳酸菌的转化方法

1．5研究目的及意义

1．6技术路线

2载体构建

2．1．2试剂及仪器设备

2．1．3培养基及溶液

2．1．4引物

2．2试验方法

2．2．1质粒pLCNICK的提取

2．2．2质粒pLP-gba的提取

2．2．3质粒A的构建

2．2．4质粒B的构建

2．2．5质粒C的构建

2．3结果与分析

2．3．1 pLCNICK质粒

2．3．2质粒A的构建结果

2．3．3质粒B的构建结果

2．3．4质粒C的构建结果

2．4讨论

2．5小结

3 类植物乳杆菌电转化条件的优化

3．1 实验材料

3．1．1菌种及质粒

3．1．2试剂及仪器设备

3．1．3培养基及溶液

3．1．4引物

3．2方法

3．2．1生长曲线的测定

3．2．2大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e的制备

3．2．3感受态细胞的制备

3．2．4电转化

3．2．5转化子的筛选及验证

3．2．7电转化条件的优化

3．3结果与分析

3．3．1生长曲线的测定

3．3．2大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pM636e

3．3．3电转化条件的优化

3．3．4转化子的验证

3．4讨论

3．5小结

4结论与展望

4．1 结论

4．1．1载体构建

4．1．2类植物乳杆菌电转化条件的优化

4．2 展望

参考文献

附录

后记

攻读学位期间取得的科研成果清单