植物乳杆菌P-8lai同源重组敲除载体的构建及电转化条件的研究

摘要

共轭亚油酸(Conjugated linileic acid，CLA)是目前公认的具有抗氧化、抗癌、减肥降脂、调节免疫力等多种生理功能的健康营养品，已广泛应用于饲料、食品、医药等多个领域，目前已成为研究的热点。许多微生物体内都含有亚油酸异构酶(linoleicacid isomerase，LAI)，它可将亚油酸(linoleic acid，LA)催化生成CLA，其中，植物乳杆菌和德式乳杆菌的转化效率最高。植物乳杆菌P-8是源自内蒙古乌拉特中旗的优良发酵菌种，经研究表明该菌具有降血脂和改善胃肠道微生物群落结构等特性，并且可高效产生CLA。因此，对植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因结构的研究与改造具有重要的理论和实用价值。
　　基因敲除技术是研究基因功能的方法之一，能精确定点的修饰和改造目的基因，而且经改造的基因片段能随着基因组的复制而稳定遗传，目前已广泛应用于各类生物的研究。
　　文章利用同源重组基因敲除技术原理，构建了植物乳杆菌P-8 lai的敲除载体，并对外源质粒电转化植物乳杆菌P-8的条件进行研究，为lai的敲除奠定了基础。根据GenBank中注册登记的lai序列，设计合成多对引物，经过多次PCR扩增得到lai-up和lai-down两同源臂片段，并成功克隆到pMD19-T载体上。将扩增得到的kan抗性基因也构建到pMD19-T载体上。利用限制性内切酶将lai-up、lai-down和kan分别从pMD19-T载体上切下并成功构建到pUC18载体上，最终得到的同源重组敲除载体，命名为pUC18△lai。经研究表明，质粒pMG36e电转化植物乳杆菌P-8的最佳电转化条件为:菌体在3％甘氨酸处理培养4h后，经2kV电压电击，最后接种于含0.4mol/L蔗糖的复苏培养基中。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 共轭亚油酸

1．1．1 共轭亚油酸概述

1．1．2 共轭亚油酸的生物学功能

1．2 亚油酸异构酶研究进展

1．2．1 亚油酸异构酶的来源

1．2．2 亚油酸异构酶的分离纯化

1．2．3 亚油酸异构酶分子生物学研究进展

1．2．4 植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶的研究进展

1．3 基因功能的研究方法

1．3．1 基因转导

1．3．2 反义技术

1．3．3 RNA干涉

1．3．4 基因诱捕技术

1．3．5 染色体转导

1．3．6 基因敲除技术

1．5 乳酸菌的转化方法

1．6 本研究的目的和意义

1．7 实验技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 主要药品与试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基

2．1．5 主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 同源重组敲除载体的构建

2．2．2 植物乳杆菌P-8外源质粒电转化条件的研究

2．2．3 植物乳杆菌P-8外源质粒电转化条件的优化

2．3 数据处理

3 结果与分析

3．1 同源重组基因敲除载体的构建

3．1．1 植物乳杆菌P-8基因组DNA的检测

3．1．2 PCR扩增lai上下游同源臂及kan抗性基因片段

3．1．3 重组质粒的菌落PCR鉴定

3．1．4 重组质粒的提取检测

3．1．5 重组质粒的酶切鉴定

3．1．6 敲除载体pUC18Δlai的鉴定

3．2 植物乳杆菌P-8电转化条件的研究

3．2．1 植物乳杆菌P-8生长曲线的测定

3．2．2 影响植物乳杆菌P-8电转化的因素

4 讨论

4．1 同源重组敲除载体的构建

4．2 植物乳杆菌P-8的电转化条件

5 结论

6 创新点

致谢

参考文献

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