铁过载诱导的小鼠前成骨细胞凋亡的分子机制研究

摘要

目的：
　　牙周炎是累及牙周支持组织的感染性疾病，可导致牙齿发生松动、病理性移位，甚至脱落。牙周炎的治疗必须联合多学科协同进行综合性的治疗。合理、正确的正畸治疗有助于牙周炎患者恢复正常的牙列形态和功能，并能改善患者的面部侧貌外观。近年来，牙周炎患者在所有矫正患者中所占的比例不断增加。然而，在牙周炎患者的矫正过程中，必须密切关注其牙周炎的发展状况。牙周的基础治疗和支持治疗必须贯穿牙周炎正畸治疗的始终。
　　牙周炎的发生发展与牙槽骨的代谢紊乱密切相关，而正畸治疗的过程也与牙槽骨的代谢和改建密不可分。铁是几乎所有生物体所必不可少的的微量元素，它参与了机体许多重要的代谢过程。研究发现，人体内的铁含量会影响骨的代谢，提示机体内的铁含量可能与牙周炎的进展相关。机体铁过载，可导致组织器官的结构改变和/或功能紊乱。近年的研究表明，铁过载可抑制成骨细胞的增殖与分化，促进破骨细胞分化和骨吸收，导致骨质疏松或骨量减少，并与细胞内游离铁催化的氧化应激相关。然而，具体的分子机制尚未明确。本研究应用枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate。FAC）建立小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的铁过载模型，探讨铁过载诱导 MC3T3-E1细胞凋亡及其可能的分子机制，为牙周炎的治疗和新药的开发提供新的思路，以及为牙周-正畸联合治疗的诊断和治疗提供实验依据。
　　方法：
　　1、体外培养MC3T3-E1细胞，分别加入0、12.5、25、50、100、200、400、800和1600μmol/L的FAC作用24、48和72 h，用WST-8法检测不同浓度的铁对细胞的增殖活性的影响。
　　2、○1用800μmol/L的FAC预处理细胞6 h，分别加入0、25、50、75、100和125μmol/L的地拉罗司（deferasirox。DFX）作用24 h；○2分别用200、400、800和1600μmol/L的FAC预处理细胞6 h，加入50μmol/L的DFX作用24 h，用WST-8法观察DFX对铁过载细胞的增殖活性的影响。
　　3、用0、400、800和1600μmol/L的FAC处理细胞后，加入DCFH-DA荧光探针，在荧光显微镜下观察以及用流式细胞仪检测细胞内活性氧（reactive oxygen species。ROS）水平。
　　4、○1用800μmol/L的FAC预处理细胞6 h，分别加入0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine。NAC）作用24 h；○2分别用200、400、800和1600μmol/L的FAC预处理细胞6 h，加入1 mmol/L的DFX作用24 h，用WST-8法观察NAC对铁过载细胞的增殖活性的影响。
　　5、分别加入0、200、400和800μmol/L的FAC处理细胞24 h后，用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡水平，Hoechst33258染色法检测凋亡细胞核的形态学改变，JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）的改变。
　　6、分别加入0、100、200、400和800μmol/L的FAC作用细胞48 h后，用Western blot检测caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和AKT的表达量的改变。
　　结果：
　　1、MC3T3-E1细胞在12.5和25μmol/L的FAC处理48 h后，与对照组相比，能显著促进细胞的增殖（P＜0.05）；400、800和1600μmol/L的FAC对细胞的增殖则有明显的抑制作用，分别作用细胞24 h（P＜0.05）、48 h（P＜0.01）和72 h（P＜0.01）后，对细胞的抑制作用均明显高于对照组。
　　2、与未加DFX干预组相比，DFX能明显缓解铁过载引起的MC3T3-E1细胞增殖抑制作用（P＜0.05），且随着DFX浓度的增加，效果越显著。
　　3、随着FAC浓度的增加，MC3T3-E1细胞内的DCF荧光强度越来越强，提示细胞内ROS的水平随着铁离子浓度的增加而升高。
　　4、与未加 NAC干预组相比。NAC（≥0.5 mmol/L）能明显缓解铁过载引起的MC3T3-E1细胞的增殖抑制作用（P＜0.05）。
　　5、铁过载可诱导MC3T3-E1细胞的凋亡，表现为：Annexin V+细胞随着铁离子浓度的增加而增加；在荧光显微镜下可观察到典型的凋亡细胞核形态学改变；凋亡终末效应酶caspase-3和其底物蛋白PARP的酶切活化。
　　6、经JC-1染色后，在荧光显微镜下可观察到铁过载的MC3T3-E1细胞表现为高绿低红，呈ΔΨm下降状态。
　　7、高铁环境下，促凋亡蛋白Bax的表达量随着铁离子浓度的增加而增加，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1表达量则随着铁离子浓度的增加而减少。
　　8、随着铁离子浓度的增加，Thr308-AKT和Ser473-AKT的表达量减少，总AKT的表达量不变。
　　结论：
　　1、少量的铁可促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的增殖，而铁过载时则对细胞增殖有明显的抑制效应，呈现浓度和时间依赖性，且该效应能被铁螯合剂DFX部分逆转；
　　2、铁过载可诱导MC3T3-E1细胞的凋亡，通过了线粒体凋亡途径，并与铁催化的氧化应激相关；
　　3、铁过载可通过抑制AKT通路的活化而抑制MC3T3-E1细胞的增殖，促进细胞的凋亡。

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前言

1. 牙周炎的治疗与正畸的关系

2. 铁稳态的失衡与疾病

3. 铁过载与牙周炎之间的关系

4. 细胞凋亡的调控及机制

5. 铁过载与细胞凋亡之间的关系

6. 本研究的目的和意义

实验材料与方法

1. 实验材料与设备

2. 实验方法

实验结果

1. 不同浓度的铁对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

2. DFX对FAC预处理细胞增殖活性的影响

3. 铁过载对MC3T3-E1细胞内ROS水平的影响

4. NAC对FAC预处理细胞增殖活性的影响

5. 铁过载诱导MC3T3-E1细胞的凋亡

6. 铁过载引起MC3T3-E1细胞线粒体膜电位的改变

7. 铁过载引起MC3T3-E1细胞Bcl-2家族蛋白表达的改变

8. 铁过载引起MC3T3-E1细胞AKT表达的改变

讨论

1. 铁对细胞增殖活性的双重效应

2. 铁过载催化活性氧的产生并诱导细胞凋亡

3. 铁过载通过抑制AKT激酶活性促进细胞凋亡

结论

展望

参考文献

英汉缩略词表

在校期间发表的文章

致谢